重组人IL-18的基因克隆与表达的研究

目的 :利用基因重组技术构建人IL 18(rhIL 18)的真核表达载体 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用RT PCR技术从外周血细胞扩增得到IL 18的cDNA并测定其核酸序列。将扩增产物酶切后克隆到pORF5质粒的NcoⅠ /NheⅠ酶切位点 ,转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性重组子 ,构建真核表达质粒pORF5 hIL 18。结果 :真核表达质粒pORF5 hIL 18在大肠杆菌JM10 9表达 ,能够诱导PBMC合成GM CSF ,具有协同rhIL 2增强NK细胞细胞毒作用的能力。结论 :重组表达的rhIL 18具有生物活性 ,可用于进一步的功能研究     

逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用研究

目的 观察逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用，探讨淋巴瘤的基因治疗方法。方法 在脂质体的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD tk细胞株，收集病毒上清，浓缩后转染Raji淋巴瘤细胞，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的Raji/CD tk细胞株。采用RT-PCR法检测双自杀基因的表达。MTT法测定转基因组及末转基因组Raji细胞的存活率。结果 双自杀基因在Raji细胞中可稳定表达，联合使用5-氟胞咳暖(5-FC)和无环鸟苷(QCV)对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-FC或GCV。结论 逆转录病毒介导双自杀基因较单一自杀基因具有更强的杀伤作用。     

Rb94对人肺腺癌细胞系A549放射增敏作用的实验研究

目的 构建人视网膜母细胞瘤基因(Rb94)真核表达载体,观察其对人肺腺癌细胞系A549的放射增敏作用并探讨其机制.方法 构建重组表达质粒pIPES-Rb94,经脂质体转染A549细胞、G418筛选获得稳定转染的细胞系.细胞计数法绘制生长曲线、计算细胞倍增时间;实时RT-PCR检测hTERT、Bcl-2mRNA的表达;成克隆实验检测pIRES-Rb94对A549细胞放射敏感性影响,计算放射增敏比(SER);流式细胞仪分析细胞周期.结果 成功构建pIRES-Rb94质粒,转染A549细胞后获得稳定转染细胞系pIRES-Rb94-A549.与A549细胞相比,pIRES-Rb94-A549细胞倍增时间延长(31.5h:39.5 h;t=5.15,P<0.01);hTERT、Bcl-2 mRNA表达下降(0.02:1.00;t=18.99,P<0.01;0.01:1.00;t=13.73,P<0.01);G2+M期细胞增加(35.91%:4.53%;t=36.78,P=0.00),G0+G1期和S期细胞减少(47.02%:74.07%;t=11.71,P=0.00和17.07%:22.32%;t=2.30,P<0.05);由D0值计算的SER为1.30.结论 Rb94对A549细胞具有明显放射增敏作用,其机制可能是G2+M期阻滞作用以及下调hTERT、Bcl-2 mRNA表达,并可能通过调节细胞周期来影响细胞增殖.     

双自杀基因CD和TK对K562细胞体内外杀伤作用的实验研究

目的:探讨双自杀基因CD和TK对K562细胞的体内外抑制作用及前体药物对肿瘤的杀伤作用。方法:将目的基因转染入K562细胞,MTT法观察细胞在体内外的增殖状况及5-FC/GCV对转染细胞的杀伤作用,电子显微镜观察其超微结构变化。将K562/CDgly TK和K562细胞接种于裸鼠皮下,观察各种肿瘤细胞在体内的成瘤情况及对前体药物治疗的敏感性。结果:单独使用GCV或5-FC对K562及K562/CDgly TK细胞产生明显的杀伤作用,联合应用该2种药物对肿瘤细胞的杀伤作用更强。将K562细胞和K562/CDgly TK细胞接种于小鼠皮下后小鼠成瘤率为100%,GCV或5-FC可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成,联合应用GCV和5-FC治疗K562/CDglyTK细胞在小鼠体内形成的肿瘤,较单独应用GCV和5-FC及对照组小鼠形成的肿瘤体积明显缩小,生存期也明显延长。结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有明显的抑制作用,可增加前体药物GCV和5-FC对瘤细胞的杀伤率。     

声动力效应抑制卵巢癌细胞的体外实验

目的研究超声激活血卟啉对卵巢癌细胞抑制的体外效应。方法应用一定强度的超声激活血卟啉,采用四甲基偶氮唑蓝法、克隆形成率方法检测抑制卵巢癌细胞的作用,并用显微镜观察处理后细胞形态的变化,流式细胞术检测细胞凋亡。结果超声激活血卟啉对抑制细胞生长有明显作用(P<0.05),且随着血卟啉浓度的升高,抑制作用明显增强(P<0.05)。同时,超声激活血卟啉的效应与超声辐照时间有关。结论声动力处理抑制细胞生长作用明显,并可以诱导凋亡。     

白细胞介素-1β增强子宫内膜基质细胞表达RANTES的研究

目的：探讨白细胞介素-1β（IL-1β）与正常T细胞表达和分泌的调节活化蛋白（RANTES）的相互关系及其在子宫内膜异位症（EMs）发病中的作用。方法：培养EMs在位内膜基质细胞作为体外实验模型,分别加入浓度为0．1、1．0、10．0ng／ml的IL-1β后采用RT-PCR、ELISA法从转录及转录后水平观察趋化因子RANTES的表达。结果：RT-PCR结果显示,基础状态下EMs在位内膜基质细胞有RANTESmRNA的表达。0．1ng／ml的IL-1β作用4h即可明显增加细胞RANTES mRNA的表达（P〈0．05）,1．0ng／ml的IL-1β作用8h时作用达高峰,随着时间的递增,mRNA水平呈递减趋势,且各浓度组之间差异无显著性。ELISA结果显示,基础状态下细胞培养上清液内有微量RANTES蛋白的表达。0．1ng／ml浓度的IL-1β作用4h即可显著诱导细胞分泌RANTES,1．0ng／ml浓度的IL-1β作用12h培养上清液中RANTES含量达高峰。结论：IL-1β可增强EMs在位内膜基质细胞对RANTES的基因表达,二者在EMs的发病过程起重要作用。     

自身免疫性血小、板减少性紫癜的特异性免疫学诊断的研究

目的 检测自身免疫性血小板减少性紫癜（AITP）患者及非免疫性血小板减少症患者的抗血小板特异性抗体,并与血小板相关抗体（PAIgG)相比较,评价其诊断及鉴别诊断价值。方法 用酶联免疫吸附竞争法检测PAIgG,改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原（MAIPA）技术检测抗血小板GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ的特异性抗体。结果 血小板特异性抗体较PAIgG的敏感性低,但特异性明显增强。结论 抗血小板特异性抗体对鉴别免疫性与非免疫性血小板减少具有重要临床意义。     

人源化抗血小板膜糖蛋白Ⅵ单链抗体的研究

,形成4.1×107个克隆.用辅助噬菌体M13K07援救TG1后产生的抗体滴度为2.62×1010cfu/ml.亲和层析后得到的纯化抗体可抑制胶原诱导的血小板聚集而对二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集无明显影响.结论 利用噬菌体抗体库技术表达的人源化抗血小板GPⅥ抗体ScFv片段可抑制血小板聚集功能.     

Rb94对人肺腺癌细胞系A549放射增敏作用的实验研究

目的 构建人视网膜母细胞瘤基因(Rb94)真核表达载体,观察其对人肺腺癌细胞系A549的放射增敏作用并探讨其机制.方法 构建重组表达质粒pIPES-Rb94,经脂质体转染A549细胞、G418筛选获得稳定转染的细胞系.细胞计数法绘制生长曲线、计算细胞倍增时间;实时RT-PCR检测hTERT、Bcl-2mRNA的表达;成克隆实验检测pIRES-Rb94对A549细胞放射敏感性影响,计算放射增敏比(SER);流式细胞仪分析细胞周期.结果 成功构建pIRES-Rb94质粒,转染A549细胞后获得稳定转染细胞系pIRES-Rb94-A549.与A549细胞相比,pIRES-Rb94-A549细胞倍增时间延长(31.5h:39.5 h;t=5.15,P<0.01);hTERT、Bcl-2 mRNA表达下降(0.02:1.00;t=18.99,P<0.01;0.01:1.00;t=13.73,P<0.01);G2+M期细胞增加(35.91%:4.53%;t=36.78,P=0.00),G0+G1期和S期细胞减少(47.02%:74.07%;t=11.71,P=0.00和17.07%:22.32%;t=2.30,P<0.05);由D0值计算的SER为1.30.结论 Rb94对A549细胞具有明显放射增敏作用,其机制可能是G2+M期阻滞作用以及下调hTERT、Bcl-2 mRNA表达,并可能通过调节细胞周期来影响细胞增殖.