抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

抗人P185 erbB2 scFv-Fc-IL-2调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞

将抗人P185erbB2scFvFcIL2融合蛋白（HFI）作用于人卵巢癌细胞株SKOV3细胞和人外周血单个核细胞（PBMC）,通过体外实验阐明HFI调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞的抗肿瘤机制,为HFI临床应用提供实验依据。〖HT5W〗方法： 〖HT5"SS〗MTT法检测细胞增殖、杀伤活性;流式细胞术观察细胞表面分子的表达水平;生物活性法检测细胞膜相关TNF杀伤活性;RTPCR检测细胞穿孔素表达水平。〖HT5W〗结果： 〖HT5"SS〗HFI处理后,未观察到对SKOV3细胞增殖活性的直接抑制作用;SKOV3细胞表面杀伤相关分子ICAM1、Fas表达率分别由24.85%、0.53%增高到85.36%、59.19%（P<0.01);人PBMC的增殖活性增强,CD3+CD8+T细胞和CD3CD16+CD56+NK细胞分别由24.37%、6.90%提高到38.80%、13.45%（P<0.01);CD25、LFA1、FasL表达水平分别由399%、86.52%、5.02%提高到12.96%、99.06% 16.19%（P<0.01);穿孔素基因、膜相关TNF均表达增强,LAK样、NK样杀伤活性在各效靶比时均明显增高（P<0.01)。〖HT5W〗结论： 〖HT5"SS〗HFI提高SKOV3细胞杀伤相关分子ICAM1、Fas表达水平,并且对人PBMC有明显的增殖活化作用,通过激活LFA1/ICAM1、Fas/FasL途径提高杀伤介质穿孔素和膜相关TNF的释放,增强LAK样、NK样杀伤活性。     

肿瘤坏死因子-α诱导腺样囊性癌细胞凋亡中p53和bcl-2基因的表达

目的　探讨肿瘤坏死因子 (TumorNecrosisFactor -alpha ,TNF -α)诱导体外人涎腺腺样囊性癌(Salivaryadenoidcysticcarcinoma ,SACC)细胞凋亡过程中P5 3与bcl- 2蛋白的表达 ,以揭示TNF -α诱导的凋亡与癌基因表达间的相互关系。方法　SACC细胞于RPMI 16 40培养液 (含 10 %胎牛血清 )中 ,37 C恒温孵育。实验组用TNF -α处理 ;对照组只加入胎牛血清作为对照。实验组与对照组均分别于 2 4、48、72小时取出细胞爬片 ,免疫组化 (SP法 )检测P5 3与bcl- 2蛋白的表达情况。结果　经TNF -α处理的SACC细胞 2 4小时后 ,细胞出现胞体变小 ,胞核固缩的凋亡早期的形态学改变。P5 3和bcl - 2蛋白表达检测 ,经RelativeIdentifiedDistributionunit(RIDIT)分析表明 ,在 2 4、48、72小时 ,实验组P5 3蛋白的高染率分别为 5 %、2 5 %、5 5 % ,bcl- 2蛋白为 15 %、2 0 %、35 % ;在 48、72小时 ,实验组与对照组均存在显著性差异 (P <0 .0 1) ;且P5 3蛋白的高染率与相应时间段的细胞凋亡率有相关性 (P <0 .0 1) ,而bcl- 2蛋白的高染率与相应时间段的细胞凋亡率无相关关系 (P >0 .0 5 )。结论　在TNF -α诱导SACC细胞凋亡的早期阶段 ,P5 3及bcl- 2蛋白表达均增强。     

颊癌P16及P53蛋白表达与临床病理的相关研究

目的探讨P16和P53在口腔颊癌中的表达特点及其与临床病理的关系。方法采用免疫组化和图像分析技术，检测32例颊粘膜白斑和扁平苔藓，30例颊癌和10例正常颊粘膜组织中P16和P53蛋白的表达水平。并将结果与病理分级、临床分期、癌转移等指标进行统计分析。结果正常颊粘膜、单纯性增生、不典型增生、颊癌中P16表达的阳性率分别为：100％、100％、90％、40％；P53表达的阳性率依次为：0、4，5％、25．5％、53．3％。颊癌P16的表达率比上皮不典型增生明显降低（P〈0．05）。颊癌P53的表达率比上皮单纯性增生明显升高（P〈0．05）。临床Ⅰ、Ⅱ期病例中P16蛋白表达水平高于Ⅲ、Ⅳ期的病例（P〈0.01）。无颈淋巴结转移病例中，P16蛋白表达水平高于有转移的病例（P〈0.05）。病理分级为Ⅰ级的病例，P53蛋白表达水平明显低于Ⅱ、Ⅲ级的病例（P〈0．01）。临床Ⅰ、Ⅱ期病例中，P53蛋白表达水平低于Ⅲ、Ⅳ期者（P〈0．05）。无颈淋巴结转移病例中，P53蛋白表达水平低于有转移的病例（P〈0.05）。P16阳性组中，P53的表达显著低于P16阴性组（P〈0．05）。结论颊癌早期P53蛋白有过度表达。P16低表达和P53高表达时提示颊癌预后较差。P16和P53蛋白的联合检测可作为临床评估颊癌浸润、转移和预后的参考指标。     

靶向抑制人木糖基转移酶-I基因的shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向抑制人木糖基转移酶- Ⅰ（XT- Ⅰ）基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体，为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖（PG）的研究奠定基础。方法根据GenBank提供的XT- Ⅰ基因序列，设计短链寡核苷酸，化学合成后经退火形成双链DNA片段，克隆到Pgenesil- 1载体中，构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，行酶切及核酸测序鉴定；将构建的XT- Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M，在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，流式细胞术检测转染效率，并采用半定量RT- PCR和Western blot分别检测转染后细胞XT- Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸测序鉴定证实，构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确；转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光；流式细胞术测定转染效率平均为50.26%；RT- PCR结果显示，WJ3显著抑制XT- Ⅰ mRNA的表达，抑制率为72.39%；Western blot结果显示，WJ3有效抑制XT- Ⅰ的蛋白表达，抑制率为70.18%。结论成功构建靶向抑制XT- Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，其中WJ3可高效抑制XT- Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达，为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础。     

优秀医院院长个性评定研究

医院院长心理素质的高低不仅影响自身的领导水平,而且也影响到医院的发展。针对我国医院领导者的特点,对获“优秀院长”称号的医院院长进行16PF测评,提出了8项医院院长所具备的心理特质。     

抗人P185erbB2 scFv-Fc-IL-2增强LAK样和ADCC杀伤作用及机制的实验研究

目的 将抗人P185erbB2 scFv-Fc-IL-2融合蛋白(HFI)分别作用于表达高、中、低3个水平erbB2受体的SKOV3、MCF-7、SGC-7901三株肿瘤细胞和健康人外周血单个核细胞(PBMC),探讨HFI调变肿瘤细胞表面分子,激活免疫效应细胞的机制;模拟体内肿瘤组织,将HFI-PBMC-肿瘤细胞混合培养,探讨HFI对分别表达高、中、低3个水平erbB2肿瘤细胞的淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)样和抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)作用,为临床应用提供实验依据.方法 MTF法检测细胞增殖、杀伤活性;流式细胞术检测细胞表面分子的表达变化;应用非核素细胞毒试剂盒观察HFI介导ADCC杀伤作用.结果 HFI处理后SKOV3细胞表面杀伤相关分子细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、Fas表达水平分别由24.85%、0.53%增高到85.36%、59.19%;SKOV3、MCF-7、SGC-7901三株肿瘤细胞erbB2表达水平分别由98.48%、42.60%、36.66%下降到94.01%、30.95%、12.36%.HFI刺激后人PBMC的增殖活性显著增强,呈时间依赖效应,CD3+ CD8+ T细胞和CD3- CD16+ CD56+NK细胞分别由24.37%、6.90%提高到38.80%、13.45%,CD25、淋巴细胞功能抗原-1(LFA-1)、FasL表达水平分别由3.99%、86.52%、5.02%提高到12.96%、99.06%、16.19%.HFI活化的人PBMC对不同erbB2表达水平肿瘤细胞的LAK样杀伤活性,在各效靶比均比对照组明显提高.HFI能够介导和增强人PBMC对表达erbB2肿瘤细胞的ADCC杀伤作用.结论 HFI上调SKOV3细胞表面杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达,下调肿瘤细胞表面erbB2表达.HFI对人PBMC具有明显的激活增殖作用,活化的人PBMC对表达不同水平erbB2肿瘤细胞的LAK样杀伤作用均显著增强.HFI能够介导和增强人PBMC对肿瘤细胞的ADCC杀伤作用,且杀伤活性的高低与肿瘤细胞表面erbB2表达水平的高低呈平行关系.     

人脑胶质瘤中COX-2表达及其与血管新生关系

目的 检测COX-2、VEGF和CD34在人脑胶质瘤中的表达,探讨COX-2、VEGF与胶质瘤微血管密度及血管新生之间的关系及意义.方法 用免疫组化SP法检测80例胶质瘤及10例正常脑组织中COX-2、VEGF和CD34的表达.结果COX-2与VEGF阳性细胞在坏死区周围及血管密集的区域分布密集,80例胶质瘤中二者表达的阳性率分别为68.8%和72.5%,正常脑组织中无表达;COX-2、VEGF的表达与MVD之间成正相关(r=0.927,r=0.939,P<0.05),COX-2与VEGF的表达成正相关(r=0.885,P<0.05),胶质瘤病理级别与COX-2、VEGF、MVD之间均成正相关(r=0.894,r=0.927,r=0.865,P<0.05).结论 COX-2和VEGF在胶质瘤的生长和进展过程中发挥重要作用,与其恶性度关系密切;COX-2可能通过上调VEGF的表达促进肿瘤组织血管新生.     

复发性涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤模型的建立及其生物学特性

目的建立人复发性涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤动物模型。方法将人复发性涎腺腺样囊性癌组织块,进行裸鼠皮下接种、传代,建立裸鼠移植瘤模型,并对其进行光镜、电镜、免疫组织化学及染色体分析。结果人复发性腺样囊性癌组织块移植于裸鼠后,获原代移植成功。2年期间移植瘤在裸鼠之间共连续传代4代,移植BALB/C裸鼠5只,平均潜伏期44.33天。经光镜、电镜、免疫组织化学观察发现移植瘤与其原发肿瘤结构特征一致。染色体检查为亚中着丝点染色体,符合人类体细胞核型。结论成功建立人复发性涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤模型并传代,移植瘤保留了原发肿瘤的组织学特征和染色体核型。