通过基因敲除研究HSP12的酒精耐受功能

目的:研究热休克蛋白12(HSP12)在酵母酒精耐受性中的作用。方法:通过对酵母酒精耐受突变株K11和其亲本株K7抽提mRNA作表达谱基因芯片杂交,研究基因表达谱的变化。对其中一条异常高表达的基因HSP12用SFH-PCR(short flanking homology PCR)的方法敲除HSP12基因,对HSP12敲除株的表型进行酒精耐受性研究。结果:基因芯片杂交结果显示K11高表达基因共有41条,其中HSP12高达50倍。但是HSP12基因敲除株对酒精的耐受性相对于未敲除株没有显著性变化。结论:在酵母很多基因共同参与对酒精的耐受性,单一基因HSP12的功能丧失,可以被其它基因的功能所弥补。     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

聚合酶链反应检测肝病患者HBV—DNA的临床意义

八十年代以来,实验诊断HBV感染,主要采用放射免疫法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA),检测血清中HBsAg、抗—HBs、HBeAg、抗—HBe和抗—HBc(下称两对半)。对HBeAg阴性病例还可检测人血清多聚白蛋白受体(PHSA—R)和聚合酶(DNA—P)。但其检测极限与血清最低感染水平相差1000倍,仍会出现假阴性。近年来采用聚合     

消化道恶性肿瘤组织中端粒酶的检测及其意义

目的 探讨端粒酶活性在恶性肿瘤诊断中的意义。方法 采用TRAP－ELISA方法,对41例消化系统恶性肿瘤及10例良性疾病组织中的端粒酶活性进行检测并相互比较。结果 恶性肿瘤细胞中端粒酶活性的检测阳性率为75．6％（31／41）,端粒酶活性与组织类型、分化程度无明显相关性;良性疾病组织中端粒酶活性的检测阳性率为20．0％（2／10）。结论 大多数消化系统恶性肿瘤组织中有端粒酶活性,端粒酶活性的检测可能成为恶性肿瘤1个诊断指标。     

TGF-β3通过抑制上皮间质转化拮抗放射性肺纤维化

目的检测分析放射性肺纤维化过程中上皮间质转化（EMT）情况,探索转化生长因子β3（TGF-β3）是否通过EMT途径抑制放射性肺纤维化的发生。方法将180只C57BL/6雌性小鼠按体重完全随机分为对照组、单纯照射组（简称照射组）和照射+TGF-β3组（简称TGF-β3组）,照射组和TGF-β3组经20 Gy 60Co γ射线单次胸部照射后,分别腹腔注射0.5 mL 0.9%的生理盐水和TGF-β3（1 μg/kg）,每周1次,于照射后1、3和6个月活杀,用苏木素-伊红（HE）染色、Masson三色染色后观察肺组织病理学改变,用免疫组化法检测肺组织EMT相关的上皮标志物紧密连接蛋白（ZO-1）和间质标志物N-钙粘蛋白（N-cadherin）的表达,用Mann-Whitney U秩和检验和Fisher确切概率法对结果进行统计分析。结果HE和Masson染色结果显示,照射能够引起小鼠肺泡壁增厚、肺泡间隔明显增宽、肺泡结构严重破坏、胶原纤维大量沉积等典型纤维化病理改变;照射后3和6个月,与照射组比较,TGF-β3组小鼠肺纤维化病变明显减轻,差异有统计学意义（Z=-2.562、-2.807,均P<0.05）,胶原沉积显著减少,差异有统计学意义（Z=2.442、2.529,均P<0.05）。免疫组化结果显示,与对照组比较,照射后1、3和6个月,小鼠肺组织ZO-1的表达量明显减少,差异有统计学意义（Z=4.492、5.831、6.064,均P<0.05）,N-cadherin的表达量显著增高,差异有统计学意义（Z=-3.269、-5.520、-6.063,均P<0.05）;与照射组比较,TGF-β3组ZO-1表达量显著增高,差异有统计学意义（Z=-2.881、-4.220、-5.695,均P<0.05）,而N-cadherin表达量显著减少,差异有统计学意义（Z=4.546、3.560、4.919,均P<0.05）。结论TGF-β3可通过抑制EMT拮抗放射性肺纤维化。     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

人类全长新cDNA ARG1的抗砷功能研究

目的 探讨人类新基因ARG1的抗砷性.方法 将ARG1阅读框克隆于真核表达载体,真核转染于人肝细胞(L-02细胞),筛选并扩增稳定表达细胞,用细胞增殖试剂盒(XTT)检测转染细胞的抗砷性.结果 低水平(3、5、8 μmol/L)亚砷酸钠(NaAsO2)时,ARG1稳定转染细胞AH组(-0.348±0.133、0.070±0.029、0.286±0.052)、AM组(-0.258±0.130、0.091±0.089、0.219±0.066)与空白对照组(0.141±0.029、0.376±0.011、0.451±0.022)和空质粒转染组(0.118±0.030、0.310±0.031、0.459±0.036)相比,细胞死亡率明显降低(P＜0.05或＜0.01);较高水平(13、20、30 μmol/L)NaAsO2时,AH组(0.624 ±0.036、0.721±0.027、0.713±0.023)、AM组(0.558 ±0.027、0.629±0.025、0.616±0.024)与空白对照组(0.621±0.016、0.673±0.011、0.666±0.002)和空质粒转染组(0.599±0.013、0.704±0.014、0.704±0.018)相比,细胞死亡率未见明显改变(P＞0.05).结论 当NaAsO2＜13 μmol/L时,细胞中过量表达的ARG1蛋白可以增加细胞抗砷性.ARG1的基因产物具有抗砷功能,是一条新的抗砷基因.     

一条人类砷相关新cDNA基因的克隆及功能预测

目的 探讨砷化物与基因的相互作用，克隆砷相关基因，利用生物信息学分析克隆基因。方法 利用SMART方法构建cDNA文库，杂交筛选并克隆基因，生物信息学对克隆基因进行结构和功能的分析。6μmol／LNaAsO2处理人正常肝L—02细胞2h，抽提RNA做基因芯片杂交。结果 成功克隆一条新cDNA基因，生物信息学分析发现7到456有一个完整的ORF，在编码起始区有典型的Kozak序列，编码149个氨基酸的蛋白质。核酸同源性比对发现与人类lp36．2—36．3染色体DNA序列同源性达98％，编码蛋白质同Alu亚家族SB序列同源性达85％。染砷细胞基因芯片杂交发现克隆基因表达增高。结论 克隆了人类砷相关基因，该基因编码蛋白质与Alu亚家族SB序列同源性高。