Naa10基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对口腔鳞癌细胞生长的影响

目的:构建人N-α-乙酰基转移酶10(N-α-acetyltransferase 10, Naa10)基因有效的慢病毒RNAi载体并转染人口腔鳞癌细胞SCC-15,研究其对口腔鳞癌细胞生长的影响。方法:根据人Naa10基因mRNA序列设计合成3个siRNA片段,转染人口腔鳞癌SCC-15细胞株并进行验证,将最有效的干扰序列克隆至pLV-shRNA载体上,测序正确后进行包装,测定病毒颗粒滴度后,将慢病毒感染SCC-15细胞以测定Naa10的表达情况,并通过生长曲线研究干扰Naa10对SCC-15细胞生长的影响。结果:3个靶点的siNaa10 均能有效抑制Naa10基因的表达,其中2号靶点最为有效(P<0.005);重组RNAi质粒pLV-shNaa10经测序证实构建成功, pLV-shNaa10可在293T细胞中成功包装;测定病毒颗粒LV-shNaa10、LV-NC滴度分别为1.2×10⁹ TU/mL和1.0×10⁹ TU/mL;SCC-15细胞感染LV-shNaa10后,Naa10蛋白表达明显降低(P<0.005);干扰Naa10可促进人口腔鳞癌细胞SCC-15的生长。结论:成功构建了Naa10 shRNA慢病毒表达载体,感染人口腔鳞癌细胞SCC-15后,有效抑制了内源性Naa10基因的表达,干扰Naa10可促进SCC-15细胞的生长。     

人SIK2重组质粒的构建和真核细胞转染

目的 构建人SIK2基因真核表达载体.方法 利用PCR扩增目的基因SIK2,PCR产物经纯化后与pC-MV-Tag 2B线性质粒进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂卡那抗性琼脂糖平板;菌落PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆后,抽提质粒,利用Lipofectamnie 2000TM试剂瞬转293T细胞,24 h后,Western Blot方法检测其在真核细胞内的表达.结果 成功构建pCMV Tag-2B-SIK2重组质粒,并在真核细胞内成功表达.结论 SIK2外源表达载体的构建成功,为进一步研究其功能奠定了实验基础.     

盐诱导激酶2对放射损伤后细胞周期检查点中的调节作用

目的 了解盐诱导激酶2（SIK2）在电离辐射诱发G₂/M细胞周期阻滞中的作用,并探讨其作用机制。方法 ⁶⁰Coγ射线照射HeLa细胞,慢病毒载体（pSicoR）构建SIK2的小干扰RNA（shRNA）表达载体,Lipofectamine2000介导转染构建SIK2敲低表达细胞模型。Western blot检测SIK2的蛋白表达含量,流式细胞术检测细胞周期,磷酸化组蛋白3（pH3Ser10）作为流式细胞检测分子标记物分析G₂/M期检测点功能。结果 γ射线照射能诱发HeLa细胞SIK2蛋白表达增加。成功构建shRNA敲低HeLa细胞SIK2表达的细胞模型,并通过该细胞模型观察到在不同剂量照射后（1、2、4、6Gy）降低SIK2蛋白表达水平导致细胞的放射敏感性增高（t=-3.445、-2.581、-3.251、-2.553,P<0.05）,γ射线诱发的细胞周期G₂/M边界阻滞在照后5、6h被提前解除（t=4.341、6.500,P<0.05）。Western blot检测结果表明,SIK2敲低细胞与对照细胞相比,放射损伤诱发的磷酸化CHK2蛋白提前消退。结论 SIK2在细胞放射损伤反应中参与细胞的G₂/M检查点功能的调节,影响细胞的放射敏感性。     

生物化学课程考试模式的改革与实践

生物化学是生命科学的核心和基础学科,又是细胞生物学、微生物学等学科的交叉学科,同时还是遗传学、分子生物学、免疫学等学科的基础学科.生物化学课程涉及到许多生物大分子的结构,空间构象庞大、内容抽象复杂,对大部分学生来说是一门较难学的课程,如果该课程的知识掌握得不扎实,将严重影响后续课程的学习.     

人类金属硫蛋白-1F cDNA基因与砷化物相互作用的研究

目的探讨砷化物作用于人类正常肝细胞后金属硫蛋白-1F cDNA基因表达的变化。方法利用SMART方法克隆cDNA基因,生物信息学分析克隆基因的同源性、染色体定位、基因结构和对该基因编码蛋白质进行分析并对该蛋白质进行跨膜信息分析,基因芯片方法检测染砷L-02细胞金属硫蛋白-1F基因的表达。结果成功克隆金属硫蛋白-1F cDNA基因,经生物信息学分析可知,该基因定位在人染色体16q13区段, 跨膜信息分析发现金属硫蛋白-1F基因编码蛋白质可以穿出生物膜,基因芯片结果证实染砷的人正常肝L-02 细胞在染砷早期金属硫蛋白-1F基因表达增高。结论发现人类金属硫蛋白-1F基因是砷化物作用的一个相关基因,早期参与了砷代谢解毒。     

提高医学生物化学课堂教学效果初探

医学生物化学是医学院校中一门非常重要的基础主干课程,在医学教育中起着承前启后的作用,是联系基础与临床的桥梁。生物化学课程教学时数多、内容丰富、研究领域广泛、概念抽象、分子结构繁多、代谢途径错综复杂、知识更新快,如果采用“灌输式”的教学方法,既会导致学生普遍认为生化基础理论课枯燥、难懂,失去学习的兴趣和动力,     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

TGF-β1在放射性肺损伤中的促纤维化作用及其机制

转化生长因子β1（TGF-β1）是一种重要的成纤维细胞因子,其表达水平能反映肺纤维化的严重程度。放射性肺损伤（RILI）包括早期的放射性肺炎（RP）和晚期的放射性肺纤维化（RIPF）。RP向RIPF发展的过程中伴随着TGF-β1表达水平的升高。了解及掌握TGF-β1在RP和RIPF发生、发展过程中的分子机制,对于RILI的防治具有重要意义。笔者就TGF-β1在RILI发生过程中的促纤维化作用及其机制进行综述。     

逆相高效液相色谱法分离四种胰岛素

牛、马、猪、羊的胰岛素仅A链的8、9、10氨基酸残基有差别。其差别是:牛胰岛素:丙~8、丝~9、缬~(10);马胰岛素:苏~8、甘~9、异亮~(10);猪胰岛素:苏~8、丝~8、异亮~(10);羊胰岛素:丙~8、甘~9、缬~(10);其余皆为中性氨基酸。作者利用恒组分洗脱系统,按逆相高效液相色谱法将这四种胰岛素进行了分离。