突变型Axin基因在神经胶质瘤细胞系C6中的功能研究

目的研究突变型Axin基因对C6细胞增殖及细胞周期的影响,以期揭示突变型Axin基因是否影响胶质瘤的发生。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪(FCM)测定细胞周期的变化,并用平板克隆形成实验对细胞克隆形成能力进行了检测。采用SP法免疫细胞化学染色法检测Ki-67、cyclinD1表达。结果转染突变型Axin基因与转染野生型Axin基因的C6细胞在生长速度,克隆形成能力方面均显著降低,且组间无差别;C6、C6-Vector、C6-Vector-Axin、和C6-Vector-Axin806各组细胞经流式细胞仪检测S期的细胞比例分别为:27.2%、24.8%、18.9%和18.5%;Ki-67及cyclinD1在转染突变型Axin基因与转染野生型Axin基因的C6细胞中表达均降低,且组间无差别。结论突变型Axin基因明显抑制C6细胞的增殖能力,该位点突变可能并不是胶质瘤发生的关键因素。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-Axin的构建及其在神经胶质瘤细胞内的表达

目的:构建真核表达载体pIRES2EGFPAxin,并在神经胶质瘤细胞系C6中进行表达。方法:用PCR的方法扩增Axin基因,构建真核表达载体pIRES2EGFPAxin,经NheI及SalI双酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染C6细胞,用荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,用免疫组化染色的方法检测细胞中Axin的表达。结果:构建了真核表达载体pIRES2EGFPAxin,用脂质体法转染神经胶质瘤细胞C6后,经荧光显微镜和免疫组化染色法检测,可见细胞内有EGFP及Axin的表达。结论:成功地构建真核表达载体pIRES2EGFPAxin,并在神经胶质瘤细胞C6中表达,为研究Axin对肿瘤的生物学作用以及Axin在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。     

SEA和B7-1基因真核共表达载体的构建及在B16细胞的表达

目的构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）和小鼠B7-1基因真核共表达载体。方法采用PCR和RT-PCR方法分别克隆了带B7-1跨膜区的SEA（SEA-B7tm）和小鼠B71基因,中间通过内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site,IRES）序列的连接克隆至真核表达载体pcDNA3.1＋。利用阳离子脂质体将重组质粒转染B16细胞,间接免疫荧光法检测B7-1和SEA分子在B16细胞膜表面的表达情况。结果测序结果与Genebank中公布的SEA、小鼠B7-1 cDNA序列相符,双标记间接免疫荧光检测结果表明B7-1、SEA同时在转染的B16细胞膜上表达。结论成功构建了SEA和小鼠B7-1真核共表达载体,为进一步研究SEA和B7-1联合应用抗肿瘤免疫治疗及其免疫机理奠定了基础。     

抗TfR scFv-SLC融合蛋白的构建、表达与鉴定

目的:构建、表达和鉴定抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体(scFv)-次级淋巴组织趋化因子(SLC)融合蛋白.方法:以pDsRed2-N1-CCL21为模板,设计引物,采用PCR扩增得到两端有EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点的SLC基因.以EcoRⅠ、NotⅠ双酶切pET28a+scFv载体和PCR产物,连接后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导TfR scFv-SLC融合蛋白的表达.SDS-PAGE、Western blot分析TfR scFv-SLC的表达特性.FCM测定scFv-SLC与肿瘤细胞结合活性.结果:EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定可见约350 bp的小片段,与SLC的理论值相符,DNA测序结果表明含有TfR scFv-Linker-SLC序列,表明pET28a+scFv-SLC融合基因表达载体构建成功.IPTG诱导产物经SDS-PAGE分析可见约41 kD的条带,符合scFv-SLC理论值.FCM结果显示TfR scFv-SLC可与MCF-7、HepG2细胞结合,且结合的阳性率较TfR scFv有所提高.结论:成功构建与表达scFv-SLC融合蛋白,且能与MCF7、HepG2等细胞特异性结合.     

冷冻保存人鼻中隔软骨

目的：探讨不同冷藏温度下保存成人鼻中隔软骨块活性的可行性。 方法：实验于2005-03／09在解放军第四军医大学基础部病理与病理生理博士后流动站完成。取临床常规手术切除的成人鼻中隔软骨15块，切成大小约15mm&;#215;10mm，随机分成3组，每组5块。分别置人4℃．-20℃和-80℃冷冻保存，在保存24h，7d，14d，20d和30d时取材，进行软骨活性比较。①软骨样品于质量浓度为40g／L甲醛固定后制备石蜡切片，组织切片经苏木精-伊红染色和阿尔辛蓝染色后于光学显微镜下观察软骨细胞及软骨基质。②锥虫蓝排斥试验检测软骨细胞活性．根据下式求细胞活力：活细胞率（％）：活细胞总数／（活细胞总数＋死细胞总数）&;#215;％。 结果：①软骨石蜡切片经苏木精-伊红染色和阿尔辛蓝染色后于光学显微镜下观察可见：冷冻保存24h时，各组软骨中大部分为活的软骨细胞充填软骨陷窝，软骨基质无明显变化，鼻中隔软骨活性程度较好。-80℃冷冻保存7d，-20℃保存14d及各组保存30d后，软骨细胞基本变性坏死，胞核消失，基质成份断裂、强度降低。4℃保存20d软骨中部有较多变性细胞，但软骨基质中酸性黏多糖及胶原成分无明显断裂现象。②-80℃冷冻保存软骨在保存24h时，软骨细胞活性为80％；保存7d时软骨基本失去活性，软骨细胞及基质变性坏死。-20℃保存软骨在保存24h时，软骨细胞活性为85％；14d后软骨基本失去活性。4℃保存软骨在保存24h至20d时仍保持较好活性，软骨细胞活性保持在60％以上，软骨细胞及基质成分无明显变化；保存30d时软骨活性降为20％左右。 结论：4℃和-20℃在2周内保存是较好的鼻中隔软骨保存方法，而4℃保存法更具优越性，有望为临床提供一种较好的活性软骨保存方法。     

小切口双极股骨头置换术治疗老年股骨颈骨折

老年人股骨颈骨折的手术方法很多,针对个体差异及个性化的治疗方案,同时为广大患者普遍接受的原则.自2004年8月～2007年12月我科对38例老年股骨颈骨折患者实行小切口双极股骨头置换术,均取得满意疗效.     

cide b蛋白在小鼠正常组织中的分布及其在胰腺组织内的定位

目的:检测c ide b蛋白在小鼠正常组织表达情况以及c ide b在小鼠胰腺中的确切定位,以期初步了解c ide b在胰腺组织中的生物学功能。方法:利用免疫组织化学———链霉素抗生物素-过氧化物酶(SP)法检测c ide b蛋白在小鼠正常组织中的表达分布;应用镜影切片染色和免疫荧光双标记染色及激光共聚焦扫描显微镜技术,观察c ide b和胰岛素在小鼠胰腺中的共定位情况。结果:c ide b蛋白除了在小鼠肝、小肠、肾等组织内表达外,在胰腺胰岛细胞中也有特异性表达;胰岛内c ibe b阳性表达细胞与胰岛素阳性细胞的分布有部分重叠的关系。结论:c ide b在小鼠胰岛β细胞特异表达,提示其可能与胰岛素的分泌、调节有关。     

热休克蛋白与凋亡

热休克蛋白是生物体受高温等刺激产生的一组应激蛋白，具有维持机体自身稳定的生物学功能，细胞凋亡是一种自主性的细胞主动死亡，与组织自稳机制有关。本文主要综述二者有关概念并初步探讨热休克蛋白与凋亡的关系及意义。     

携带人MAGE-1基因重组腺病毒的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建人黑色素瘤相关抗原-1(MAGE-1)基因的腺病毒,并研究其感染肝癌细胞系HepG2细胞的效率.方法 采用基因克隆技术,将人MAGE-1基因克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP中,构建pShuttle-MAGE-1-IRES-hrGFP质粒,利用细菌BJ5183将穿梭质粒与pAdEasy-1进行重组,获得重组的腺病毒质粒.线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增.采用CsCl密度梯度离心进行病毒浓缩和纯化.获得的腺病毒感染肝癌细胞HepG2,观察其感染效率和MAGE-1表达水平.结果 通过酶切鉴定证明腺病毒载体构建成功,包装出携带人MAGE-1基因的腺病毒,滴度达2.1×1010pfu/mL,获得的腺病毒对HepG2细胞的感染效率高于98%以上.结论 成功地利用细菌内同源重组方法构建了携带人MAGE-1基因的腺病毒,并能够在肝癌细胞中高效地表达,为利用MAGE-1进行免疫治疗提供了材料.     

人工培养蛹虫草与冬虫夏草的比较研究

目的：为蛹虫草的开发利用提供依据。方法：从生物学地位及资源状况、化学成分和安全性评价等方面对蛹虫草和冬虫夏草进行详细的比较分析。结果：蛹虫草与冬虫夏草是同一个属;子实体三大营养素总量略高于冬虫夏草,脂肪含量是冬虫夏草的一半左右;虫草酸含量稍低,其他特殊成分含量都很高,特别是虫草素的含量远高于冬虫夏草;对小鼠急性经口毒性试验表明蛹虫草属实际无毒级。结论：人工培养蛹虫草可以替代冬虫夏草使用。