人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人LIGHT胞外段基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:从人外周血单核细胞来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR得到LIGHT胞外段基因,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果:RT-PCR扩增出了大小为543 bp 的LIGHT胞外段基因,经测序证明序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的蛋白.结论:成功地克隆了人LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL的构建表达与活性鉴定

目的:构建新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL的原核表达载体,诱导表达后检测其生物活性.方法:PCR扩增绿脓杆菌外毒素A PE40KDEL基因插入到pET32a(+),然后与合成的含有肠激酶酶切位点和肝癌特异性结合肽A54的核酸序列连接,构建重组表达载体pET32a(+)-A54-PE40KDEL,其经鉴定后转化E.coli BL21 表达.超声破菌,上清液经Ni+亲和层析纯化,肠激酶酶切,再次Ni+离子亲和层析后得到免疫毒素A54-PE40KDEL.MTT和间接免疫荧光技术检测其对不同细胞株的细胞毒性及靶向性.结果:重组质粒序列正确,经Western blot证实表达产物含Mr约58 000的目的蛋白.A54-PE40KDEL能够与肝癌细胞特异性结合,且对肝癌细胞的毒性作用与对照相比有极显著性差异(P＜0.01).结论:成功构建了A54-PE40KDEL原核表达载体;获得的新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL在体外与肝癌细胞具有一定结合特异性及杀伤活性,为肝癌导向治疗提供了一条可行的途径.     

H_2O_2体外抗棘阿米巴作用研究

目的检测H_2O_2的抗棘阿米巴(Acanthamoebaspp.)作用。方法自角膜炎患者角膜刮片分离获得棘阿米巴复合体(AcanthamoebaLugdunensis-Acanthamoebaquina)。于培养基(PYG)培养传代。实验前将棘阿米巴用新鲜的PYG培养1d使其活化,配成2.5×10~6/ml细胞悬液加入细胞培养板,实验组各孔分别加入不同浓度H_2O_2,对照组加等量PYG,28℃24h后实验组更换新鲜PYG继续培养3d。取细胞悬液滴片,瑞氏染色,观察细胞形态变化。用定量培养法作棘阿米巴生长曲线,观察其增殖速率。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,观察H_2O_2对棘阿米巴成活率的影响。用乳酸脱氢酶(LDH)测定法测定H_2O_2对棘阿米巴的损伤。结果棘阿米巴滋养体在0.125％H_2O_2作用下,不可逆转地成为包囊,20～120h增殖率为0;1％H_2O_2可使其破裂。结论H_2O_2具有较强的抗棘阿米巴作用,有可能成为预防棘阿米巴角膜炎的理想药物。     

棘阿米巴对黑色素瘤细胞毒性作用初探

目的 :探讨棘阿米巴滋养体分泌物中对小鼠黑色素瘤细胞B16起细胞毒作用的物质。方法 :采用MTT (四甲基偶氮唑盐 )法检测棘阿米巴滋养体分泌物对B16的细胞毒作用。结果 :MTT法表明棘阿米巴分泌物对靶细胞有一定的细胞毒作用 ,丝氨酸酶抑制剂可抑制大部分的细胞毒作用。 6 0 %硫酸铵可沉淀大部分起细胞毒作用的成分 ,主要为丝氨酸酶类。结论 :棘阿米巴滋养体分泌物在棘阿米巴致靶细胞损伤中起重要的作用 ,特别是其中的丝氨酸蛋白酶类物质     

中国人群中Del表型分子背景研究

目的研究Del表型的分子基础，并探寻新的Del等位基因。方法515名经血清学方法确定的RhD阴性血样用吸收放散试验筛选并确认Del表型。Del的基因组DNA通过多重PCR（ multiplex polymerase chain reaction, MPX PCR）检测RHD基因；用序列特异性引物PCR（ sequence-specific primer-polymerase chain reaction, PCR-SSP）检测Del等位基因：RHD（K409K）和RHD（M2951）。经PCR-SSP筛选，结果为阴性的样品通过基因组DNA测序及cDNA测序分析其分子背景。结果吸收放散试验共检出Del 79名。经多重PCR检测，79份样品均带有RHD第3、4、5、6、7、9特异性外显子。PCR-SSP结果显示，75名Del具有RHD（K409K）等位基因，无Del样品带有RHD（M2951）等位基因。经测序发现4名新RHD等位基因：RHD3G→A（GenBank DQ310735），RHD 28C→T，RHD53T→C（GenBank DQ451877、DQ451878），RHD 251T→C（GenBank DQ310734）。结论Rh血型系统非常复杂，新的D变异表型和新的RHD等位基因可能被不断发现。     

肝癌细胞特异性内在化肽的筛选和初步鉴定

应用噬菌体肽库技术筛选与肝癌细胞特异性结合并可以内在化的短肽,为肝癌的导向治疗奠定基础。以肝癌细胞株BEL-7404作为筛选靶细胞,对噬菌体展示随机12-肽库进行亲和淘选。经过3轮淘选后,共随机挑选出20个噬菌斑进行扩增和测序,同时用细胞ELISA检测其与肝癌细胞的结合情况,并通过免疫荧光术、流式细胞术等方法进一步鉴定噬菌体克隆对肝癌细胞的导向性及内在化的效果。结果表明3轮淘选所得的噬菌体回收率逐步提高,显示淘选过程对随机肽库有一定的富集效果。从扩增的噬菌体克隆中选择结合力最强的LJ08通过免疫荧光术、流式细胞术鉴定,结果显示LJ08与肝癌细胞呈特异性结合并内在化进入肝癌细胞。结论认为,通过对噬菌体随机肽库的筛选,得到可以与肝癌细胞BEL-7404结合并可以内在化的噬菌体肽,为该肽作为肝癌导向治疗的药物载体奠定基础。     

哺乳动物卵泡发育的调控机制

哺乳动物卵泡发育是一个极为复杂的过程。卵泡主要是由一个生殖细胞及外围众多的颗粒细胞和卵泡膜间质细胞等组成。在促性腺激素等的作用调控下,卵泡中颗粒细胞增殖、分化,产生分化程度不一的颗粒细胞群。颗粒细胞又通过旁分泌和间隙连接的通讯方式控制卵母细胞的生长和成熟,因而卵泡发育是处在一个庞大的调控系统严格控制之下。本文综述了生长期和成熟期调控机制及人工诱导卵泡发育、成熟和卵成熟的一些思路。     

不同染色法对流式细胞术中DNA含量检测的影响

流式细胞术是目前对细胞进行定性和定量分析最有效的手段之一.本文从染色方法和染色样品存放时间在使用流式细胞术中对染色结果的影响进行了比较,旨在寻求一种简便、灵敏且重复性好的染色方法.流式细胞仪分析结果显示一步法同时具备了以上优点,并用经不同浓度三尖杉酯碱(HT)处理的HL-60细胞进行了验证.     

Rh蛋白家族及Rh复合体

Rh血型系统的抗原具有强烈免疫原性,主要由RhD、RhCE蛋白携带。RhAG糖蛋白是一类重要的Rh相关蛋白,影响Rh蛋白在红细胞表面的表达。近年来发现红细胞膜表面的其它一些蛋白,诸如LW糖蛋白、血型糖蛋白B,可参与Rh复合体的形成。Rh复合体是近年研究热点。目前已发现Rh复合体除携带Rh抗原外,还影响红细胞的形态稳定,可能还具有离子通道功能。     

G蛋白偶联受体56胞外端融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:制备G蛋白偶联受体56(G protien-coupled recepter 56,GPR56)的高效抗体,为其功能及分子机制的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测工具。方法:以肝癌细胞株MHCC-97H的cDNA为模板,利用PCR技术扩增GPR56 N端序列(661~1 073 bp),并构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N。阳性克隆经酶切、测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。表达产物经Western blot初步鉴定后,用GST磁珠分离纯化,纯化后蛋白与免疫佐剂混合直接免疫家兔制备抗血清。阳性血清用ELISA、Western blot、免疫组织化学等技术对细胞或组织中的GPR56进行鉴定和分析。结果:成功构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N,GPR56N与GST的融合蛋白(GST-GPR56)在原核系统中进行了高效的可溶性表达,制备的兔抗人GPR56抗体经Western blot和免疫组织化学分析结果表明,该抗体可同时对人源性和鼠源性的GPR56进行特异性检测。结论:成功对GPR56蛋白N端序列进行了原核表达和纯化,制备的抗GPR56多克隆抗体具有较高的特异性,为GPR56功能及分子机制的深入研究奠定了坚实的基础。