shRNA干扰S100A13基因对人甲状腺癌细胞释放成纤维细胞生长因子1的影响

目的 探讨S100A13基因沉默对应激诱导人甲状腺癌细胞(TT细胞)成纤维细胞生长因子1(FGF-1)释放的影响.方法 将S100A13-shRNA pENTRTM/U6入门质粒转染TT细胞,应用实时PCR、间接免疫荧光法及Western印迹方法检测细胞内S100A13基因及蛋白表达的抑制效率,应用间接免疫荧光,RT-PCR及ELISA检测无血清处理TT细胞S100A13沉默后FGF-1释放变化.结果 S100A13-shRNApENTRTM/U6入门载体转染TT细胞后能够抑制S100A13基因及蛋白表达,抑制效率约为80%.间接免疫荧光法显示FGF-1主要位于细胞浆和细胞核,无血清培养6 h后胞浆内FGF-1基本消失.RT-PCR和ELISA结果均显示,S100A13沉默能降低无血清处理TT细胞培养上清中FGF-1的浓度(P＜0.05).结论 S100A13-shRNA pENTRTM/U6入门载体能有效、特异性地抑制S100A13基因及蛋白表达.S100A13基因的抑制可以减弱FGF-1从细胞内释放到细胞外的过程.     

抗甲状腺药物致Graves病患者粒细胞缺乏高表达基因的筛选与克隆研究

目的 筛选可能对抗甲状腺药物(ATD)致Graves病(Graves disease,GD)患者粒细胞缺乏起决定作用的相关基因.方法 采用淋巴细胞分离液分离GD服用ATD导致粒细胞缺乏患者与粒细胞正常患者的单个核细胞,加入EB病毒进行细胞培养,应用抑制性消减杂交(SSH)的方法构建GD服用ATD导致粒细胞缺乏患者与粒细胞正常患者之间差异表达的cDNA消减文库,克隆、鉴定ATD介导GD患者粒细胞缺乏特异性高表达的基因片段,以生物信息学方法进行初步分析.结果 成功构建了人ATD介导GD患者粒细胞缺乏的cDNA消减文库;初步筛选到34条EST,其中21条为新EST,它们可能代表着在ATD介导GD患者粒细胞缺乏中特异性高表达并对ATD介导GD患者粒细胞缺乏的发生有促进作用的新基因.结论 高效消减文库的成功建立,对进一步筛选、克隆GD差异表达的未知新基因和已知基因的新生物学功能研究具有重要意义.     

利拉鲁肽对肥胖大鼠胰岛素敏感性的影响

目的研究利拉鲁肽对高脂饮食喂养的肥胖大鼠胰岛素敏感性的影响。方法将24只雄性SD大鼠随机分为2组各12只。分别予以高脂饮食、高脂饮食加大剂量利拉鲁肽腹腔注射。喂养8周后检测体重、空腹血糖、HOMA-IR水平的变化。结果高脂饮食喂养使大鼠体重增加、空腹血糖升高,发生胰岛素抵抗;利拉鲁肽能够显著抑制高脂饮食喂养导致的体重增加,改善胰岛素抵抗。结论利拉鲁肽能够显著抑制高脂饮食喂养导致的体重增加,降低血糖,改善胰岛素抵抗,提高胰岛素敏感性,增强胰岛β细胞功能。     

基因的miRNA载体构建及其活性鉴定

目的 构建蛋白质精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)基因的miRNA真核表达载体,鉴定其转染乳腺癌MCF7细胞株后的生物活性.方法 根据PRMT2基因序列设计合成4对pre-miRNA片段,定向克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体上,采用菌落的PCR和测序分析鉴定插入序列的完整性;并将重组载体转染至MCF7细胞株中,采用Western blot方法鉴定重组载体转染MCF7细胞后对PRMT2蛋白表达的干扰效果以确定其生物活性.结果 构建的重组体插入片段的碱基序列完全正确,并且重组体瞬时定转染MCF7细胞后成功干扰PRMT2的表达.结论 成功构建了靶向PRMT2基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体,且在瞬时转染MCF7细胞后能下调PRMT2的表达.     

S100A13基因的高表达对HepG2细胞生物学性状影响的研究

目的 观察S100A13基因的高表达对HepG2细胞生物学性状的影响.方法 采用以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒PcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,经脂质体介导转染肝癌细胞系(HepG2);荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达S100A13的细胞克隆并检测转染前后细胞FGF1表达量的变化;MTT观察阴性对照组、转染空载体组和转染重组基因组的细胞生长曲线.各组分别加入化疗药物(5-Fu),24h后收集细胞,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 转染后的重组细胞系S100A13表达明显增高,转染PcDNA3.1/NT-GFP-S100A13组FGF1的表达量明显高于阴性对照组及空载体组.但各组细胞的生长曲线以及对化疗药物(5-Fu)的敏感性差异无显著性.结论 S100A13及其介导释放的FGF1在肿瘤的增殖及对抗癌药物的敏感性方面均没有明显的作用.     

甲状腺癌组织中S100A13、FGF-1表达及意义

目的探讨S100A13、FGF-1在甲状腺癌中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学法,检测56例甲状腺癌、15例甲状腺腺瘤、14例甲状腺正常组织中S100A13及FGF-1的表达。结果S100A13与FGF-1阳性染色定位于细胞质。S100A13在少部分腺瘤和正常组织中阳性染色定位于细胞核。S100A13表达阳性率分别为甲状腺癌91．1％、甲状腺腺瘤66．7％、甲状腺正常组织64．3％;FGF-1表达阳性率分别为89．3％、60．0％、57．1％;甲状腺癌与其他各组比较均有显著性差异（P〈0．05）。FGF-1在乳头状癌中阳性表达率（100．0％）显著高于髓样癌（69．2％）（P〈0．05）。结论联合检测S100A13与FGF-1表达对鉴别甲状腺癌具有重要意义,两者表达水平可能与甲状腺癌的发生及转移相关。     

蛋白质精氨酸甲基转移酶2在乳腺癌细胞中的表达及其对SKBR-3细胞生长特性的影响

目的:探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶2(protein arginine methyltransferase 2,PRMT2)基因在多种乳腺癌细胞株中的表达情况,以及外源性PRMT2基因过表达对乳腺癌SKBR-3细胞生长特性的影响.方法:采用real-time RT-PCR法检测PRMT2基因在不同乳腺癌细胞株中的表达,并建立稳定表达pcDNA3.1/NT-GFP-PRMT2的SKBR-3细胞株;激光共聚焦显微镜下观察外源性PRMT2蛋白在细胞中的定位,检测在雌激素和雌激素受体(estrogen receptor,ER)拮抗剂4-OHT作用下过表达PRMT2基因对SKBR-3细胞增殖的影响.结果:PRMT2基因在ERα阳性乳腺癌细胞株中表达水平明显高于ERα阴性乳腺癌细胞株;在转染PRMT2基因的SKBR-3细胞株中,雌激素反应元件-荧光素酶报告基因(estrogen response elements-luciferase reporter,ERE-luc)的转录活性明显升高.在无处理因子情况下,外源基因PRMT2在SKBR-3细胞中的表达对细胞的形态及生长速度无明显影响.与未转染及转染GFP空载体的SKBR-3细胞相比,稳定转染PRMT2基因的SKBR-3细胞对雌激素的敏感性明显下降,但其对4-OHT处理的敏感性降低无明显差异.结论:PRMT2基因表达的多少及部位与乳腺癌细胞中ERα的表达密切相关.外源性PRMT2基因在乳腺癌SKBR-3细胞中稳定表达使细胞对雌激素的敏感性降低,但不增加细胞对ER拮抗剂4-OHT的耐药性.     

PRMT2及其剪接体在乳腺癌MCF-7细胞中的亚细胞定位及意义

目的：构建蛋白质精氨酸甲基转移酶2( PRMT2)及其差异剪接体与绿色荧光蛋白( GFP)的真核表达载体,转染后观察其融合蛋白在乳腺癌MCF-7细胞中的表达及亚细胞定位,为进一步研究PRMT2基因及其新的差异剪接体在乳腺癌中的作用奠定基础。方法以pGEM-T-PRMT2/α/β/γ载体为模板,设计引物,PCR扩增目的基因,并将PCR产物克隆至pcDNA3.1/NT-GFP-topo载体,转化后将阳性克隆扩增,对 PCR 产物进行跑胶鉴定和测序。提取 pcDNA3.1/NT-GFP-PRMT2/α/β/γ及空载体pcDNA3.1/NT-GFP质粒,用脂质体介导转染MCF-7细胞,在激光共聚焦显微镜下,观察外源性PRMT2/α/β/γ融合蛋白在MCF-7细胞中的亚细胞定位。采用Western blot法检测各重组融合蛋白在MCF-7细胞中的表达。结果各GFP在细胞中均有表达,但其在细胞中的分布位置不一致。 PRMT2α与PRMT2γ的融合蛋白同PRMT2的分布一致,均聚集于核仁外的核浆,胞质中有少许分布;而PRMT2β和空载体的荧光蛋白的分布一致,都均匀分布于细胞的胞质和胞核,包括核仁部分。 Western blot法检测表明各重组融合蛋白在MCF-7细胞中均有表达。结论 PRMT2及其各剪接体的亚细胞定位不同,可能提示其在功能方面存在差异。