用登革热病毒抗原体外免疫人淋巴细胞重建小鼠免疫功能的研究

目的研究特异性抗原体外免疫人淋巴细胞在严重联合免疫缺陷（ＳＣＩＤ）小鼠重建免疫系统功能的方法。方法用２型登革热病毒（ＤＶ２）抗原体外免疫人扁桃体淋巴细胞，再腹腔移植ＳＣＩＤ小鼠，并用不同剂量抗原加强免疫。结果在ＳＣＩＤ小鼠接受人淋巴细胞移植后第２周，以酶联免疫吸附法检测血清中出现的人ＩｇＧ，最高达４１２．８６μｇ／ｍｌ；实验第２、４周，血清中分别出现抗ＤＶ２特异性ＩｇＭ、ＩｇＧ和中和抗体，滴度最高达１∶６４００，其水平和产生动态与抗原量有关；应用免疫组织化学技术观察到ＳＣＩＤ小鼠脾、肺、小肠及肠系膜中有人ＣＤ＋２０、ＣＤ＋３、ＣＤ＋４、ＣＤ＋８淋巴细胞定居，其分布与人相应组织淋巴细胞分布相似；且小鼠脾细胞培养液中也测到抗ＤＶ２人ＩｇＧ。结论结合体内外免疫，可对ＳＣＩＤ小鼠诱发较强的免疫应答，成功地重建免疫系统。     

PCR制备地高辛配基标记的探针检测登革病毒核酸

用聚合酶链反应(PCR)技术，以重组质粒PDEⅡ305 DNA为模板．在底物中补充标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(DIG-dUTP)，经扩增反应制备了地高辛配基标记的登革病毒2型(DEN2)cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针有DEN2型特异性，可检出0．1pgDEN2-RNA。PCR扩增标记只用10ng模板DNA，数小时内可制备约1ug标记的cDNA探针，而用六聚棱苷酸随机引物(RHP)标记，从质粒DNA酶切、片段回收到标记获得探针，至少需数10h。可见PCR技术直接制各地高辛配基标记的cDNA探针较方便，快速、标记率高、特异性强，具有一定的应用前景。     

PCR/RFLP对临床标本沙眼衣原体直接基因分型

建立泌尿生殖系统沙眼衣原体感染阳性标本直接基因分型方法。先用敏感的扩增沙眼衣原体特异质粒的引物扩增５００份临床标本，初筛选出１００份阳性标本再用扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）基因的引物扩增，并用嵌套式ＰＣＲ使阳性标本能扩增出ＭＯＭＰ基因，对获得的ＭＯＭＰ基因用限制性酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）方法进行基因分型，并用银染观察结果。其中Ｅ型比例最高，占４７％；Ｆ型为１６％；Ｄａ、Ｇ型均为６％；Ｂａ、Ｄ型各占５％；Ｈ型及Ｋ型均为１％，混合型Ｋ／Ｆ型２％；混合型Ｄ／Ｊ、Ｅ／Ｇ均为１％；未能分型有９％。     

性伴侣泌尿生殖道沙眼衣原体基因分析

从性病专科门诊收集了５对性伴侣的泌尿生殖道沙眼衣原体ＰＣＲ阳性标本，对其进行ＭＯＭＰ－ＰＣＲ扩增和ＲＦＬＰ图谱分型及序列分析。将１５种衣原体标准株的ＭＯＭＰ基因用ＡｌｕⅠ等内切酶作ＲＦＬＰ图谱，根据已发表的１５种血清型标准株的四个多变区序列及已发表的...     

抗登革病毒单克隆抗体诊断盒的应用

应用４株Ｉ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型登革病毒特异性单克隆抗体组成的诊断试剂盒，用荧光抗体技术特异而敏感地鉴定了Ⅰ～Ⅳ型登革病毒原型株和２０个地方株的型别．并于１９９０－１９９３年间广州市及佛山市登革热流行时，对从病人血清分离的登革病毒准确而快速地进行型别鉴定。     

登革2型病毒重组E蛋白的生物学特性分析

【目的】检测重组D2V全长E蛋白纯化后的免疫反应性与抗原性,为其亚单位疫苗研制奠定基础。【方法】酵母表达上清超滤浓缩后用金属螫合亲和层析(MCAC)法过柱,用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术观察蛋白条带。将纯化蛋白与组氨酸抗体、D2V E单抗进行斑点印迹和蛋白印迹,以确定纯化物是否为合组氨酸尾的D2V E融合蛋白,并用ELISA检测纯化E蛋白与不同DV抗体的结合反应。用纯化的重组D2V E蛋白免疫小鼠后测定其产生的抗体类型与滴度,以分析其抗原性。【结果】表达产物经MCAC柱纯化获得单一的相对分子质量为69×10~3的蛋白,组氨酸抗体与D2V E单抗的印迹试验证实该条带就是含多聚组氨酸尾型特异的重组E蛋白(rEgp),ELISA显示纯化的rEgp保留有免疫反应性及型特异性,内糖苷酶H消化证实其含有N联高甘露糖残基。接种rEgp可诱生针对D2V抗原与重组E蛋白的高效抗体。【结论】纯化的D2V全长E蛋白保留其免疫原性和免疫反应性,并具有型特异性。     

流行性乙型脑炎病毒与人血管内皮细胞相互关系研究

应用人脐带静脉内皮细胞体外培养系统首次建立流行性乙型脑病毒感染人血管内皮模型，发现ＥＣ是ＪＥＶ的易感细胞并能支持ＪＥＶ在细胞中增殖。感染病毒的ＥＣ胞浆中检出ＪＥＶ抗原及可疑ＪＥＶ颗粒，但未见明显的形态学异常。     

登革病毒1型和2型国内分离株NS1基因的扩增和克隆

登革病毒(DEN)为单链正股RNA病毒,其非结构蛋白NS1在病毒免疫反应中起重要作用。我们在NS1基因序列设计了一对通用引物,扩增序列长度为413bP。应用逆转录—聚合酶链反应成功地扩增了DEN1_-4型部分基因片段,采用该引物扩增国内分离株DEN1(GZ)和DEN2(HN91)同样出现一条特异扩增带,并发现国内分离株扩增产物的电泳迁移率与国际参考株有差别。因此我们应用低融点琼脂糖回收该DNA片段,并将DEN1(GZ)和DEN2((HN91)NS1基因部分片段分别克隆到Puc19质粒载体中。经Pst Ⅰ和Ecor Ⅰ双酶切分析和通用引物PCR鉴定证明重组质粒内含有NS1基因部分片段。并准备进行核苷酸序列分析,以进一步了解其核苷酸的变异与抗原性的关系,为我国登革热的预防和控制提供理论依据。