人肝再生磷酸酯酶2(PRL-2)的原核表达及其鸡卵黄抗体的制备

目的 :原核表达人肝再生磷酸酯酶 2 (PRL 2 )与谷胱甘肽S转移酶 (GST)和 6个串联组氨酸 (6×His)的融合蛋白 ,并制备GST PRL 2特异性鸡卵黄抗体。方法 :将人PRL 2cDNA的全长蛋白编码序列 ,克隆入两种原核表达载体pGEX 4T 2和pET2 1a中 ,在大肠杆菌BL2 1中诱导表达融合蛋白。用Glu tathioneSepharose 4B和Ni NTAagarose亲和柱分别纯化目的蛋白。以纯化的GST PRL 2融合蛋白免疫产蛋母鸡制备多克隆抗体 ,应用 6×His PRL 2对抗体进行亲和层析纯化 ,纯化产物用Westernblot进行分析。结果 :得到高表达量的融合蛋白 ,经亲和层析柱纯化后获得较高纯度的GST PRL 2和 6×HisPRL 2融合蛋白。以GST PRL 2融合蛋白免疫鸡得到抗PRL 2的多克隆抗体 ,Westernblot证实 ,经 6×HisPRL 2亲和层析纯化的抗体 ,能够识别 6×His PRL 2和GST PRL 2融合蛋白 ,但不同GST蛋白起反应 ,表明具有较高的特异性。结论 :利用原核表达的人PRL 2融合蛋白制备的抗PRL 2多克隆抗体具有较好的特异性 ,为研究PRL 2蛋白在细胞信号转导过程中的作用提供了重要的技术和材料保障     

人微小RNA-133a(miR-133a)重组腺病毒的构建和鉴定

目的:构建人miR-133a重组腺病毒,研究其在人骨髓间充质干细胞(hMSCs)中的表达。方法:从人基因组DNA中扩增包含miR-133a的PCR产物,并定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV。将经pmeⅠ线性化的重组穿梭载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒rAd-mir-133a。将rAd-mir-133a在人胚肾293细胞(HEK293)中包装并扩增出miR-133a的重组腺病毒。将重组腺病毒感染hMSCs,利用RT-PCR和实时定量PCR分别检测初级miR-133a和成熟miR-133a的表达。结果:限制性内切酶分析和DNA测序结果显示,重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-miR-133a构建正确。在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd-miR-133a。rAd-miR-133a感染的hMSCs中初级miR-133a转录子和成熟miR-133a表达显著增强。结论:成功构建了人miR-133a重组腺病毒,并在hMSCs中高效表达出miR-133a,为进行miR-133a的功能研究创造条件。     

RNA干扰MAGEA3对人肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人肝癌细胞中黑色素瘤相关抗原A3(MAGEA3) 的表达和对肝癌细胞凋亡的影响。 方法:构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，采用脂质体介导的方法将其转染到人肝癌细胞(mel-ed1)中，用Western印迹法、RT-PCR检测MAGEA3基因在肝癌细胞中的表达；通过原位末端标记TUNEL法、DNA片段化及Annexin V /PI双标记法检测，观察其对肝癌细胞凋亡的影响。 结果:成功构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的MEL-ED1细胞中MAGEA3基因表达显著抑制(90%)。与对照组比较, pSilencer-MAGEA3转染组肝癌细胞培养 48 h 后,DNA片段化检测出“DNA ladder”、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征, Annexin V /PI双标检测转染组细胞凋亡率为21.41%±1.98%,明显高于pSilencer-neo 空载体转染组和未转染组(P<0.01)。 结论:MAGEA3小发夹RNA质粒载体可显著抑制MEL-ED1细胞中的MAGEA3基因的表达,促进肝癌细胞的凋亡, MAGEA3基因具有抑制凋亡的作用。该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

人肝癌细胞系H4M的建立及其遗传特征分析

目的采用原代细胞培养方法，在体外建立一株人肝癌细胞系H4M，并对其遗传学特征进行分析。方法将分离的瘤细胞制成单细胞悬液，用含20％胎牛血清的DMEM培养液培养该细胞系，采用染色体G显带方法进行细胞遗传学分析，用对比基因杂交法分析肿瘤细胞基因组遗传学改变情况，并采用DNA—PCR方法检测等技术分析该细胞系周期素D1扩增情况。结果染色体G带显示H4M细胞为超3倍体，其中有一条染色体含有一长的同质染色区（homogeneously staining region，hsr）。比较基因组杂交（CGH）分析显示，H4M的细胞遗传学改变为2，5，6p，7p，11p，13q21．3-qter增加，而11q13为高拷贝数扩增，8pter—p12，9，13q11—q21．2，16q，17pter—p12，19p和Xpter—q13丢失。H4M细胞系的CCND1基因有明显的扩增。结论通过原代培养建立的肝癌细胞系H4M与原发癌保持相同的生物学特性，体外连续传代60代以上，细胞形态不变，生长周期恒定，可望成为一个稳定的细胞系。     

液-质联用分析肝癌细胞HLA-A2类分子递呈的抗原肽

目的：寻找MHCI类分子递呈的、T淋巴细胞识别的肝癌抗原肽。方法：人肝癌细胞系hHCC以枸橼酸－磷酸盐（pH3.3)液洗脱,洗脱物经粗分离,得到相对分子质量（Mr)＜5000的各种多肽组分混合液;取各组分多肽分离液分别与抗原加工缺陷细胞（T2,HLA－A2）进行细胞表位重建,加入特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL),^51Cr释放法测杀伤活性;选活性值高的抗原肽组分进行反相高效液相色谱－质谱（RP－HPLC－MS）检测,对活性峰手工读谱分析其一级结构;最后进行氨基酸同源性分析。结果：酸洗10^10hHCC细胞,样品蛋白质浓度2mg/ml;通过RP－HPLC－MS检测,其质谱图经手工解析,氨基酸序列为SXXVHXNEV,X＝1或L;氨基酸同源性分析证明SXXVHXNEV为SLIVHLNEV,是肝细胞生长因子受体的第1075－1083肽段,第1080位点发生突变,由F变为L,由HLA－A2分子递呈。结论：细胞膜温和酸洗技术结合RP－HPLC－MS联用技术,是寻找肝癌抗原肽的有效方法,尚未见相同研究报道。发现的肝癌抗原肽SLIVHLNEV是肝细胞生长因子受体的突变物,可能具有重要生物学意义。     

一个新的MAGE—1表位为肝癌细胞表面HLA—B7分子递呈

目的：肿瘤抗原的存在是机体识别肿瘤并激活免疫系统的物质基础。机体抗肿瘤免疫以细胞免疫为主,故寻找被T细胞识别的肝癌细胞抗原肽,为肝癌免疫治疗奠定基础。方法：对于肝癌细胞系HHCC（HLA-A2,A29,B7,B51）,应用细胞膜酸洗技术使抗原肽从细胞膜表面脱落,经过凝胶层析,反相高效液相色谱层板得到不同组份多肽,高效液相色谱=质谱仪联用技术获得抗原肽的一级结构。通过氨基酸锚定位点分析,预测其HLA配体类型;互联网上氨基酸同源性分析确定其同源性用技术获得抗原肽的一级结构,通过氨基酸锚定位点分析,预测其HLA配体类型,互联网上氨基酸同源性分析确定其同源性序列;人工合成抗原肽,HLA同型树突状细胞递呈合成抗原肽刺激特异性CTL反应,^51Cr杀伤实验检测CTL对肿瘤细胞系的杀伤作用。结果：经过反相高效液相色谱层析后可以获得10多个组份,其中一个组份经过液质联用鉴定和氨基酸同源性分别确定其序列为EPVTKAEML,是黑色素瘤抗原-1,MAGE-1（121-129）表位。由HLA-B7分子递呈,体外诱导实验表明其可以诱导出较强的CTL反应。结论：液质联用技术是寻找抗原肽的有效方法,MAGE-1抗原肽EPVTKAEML地于HLA-B7阳性及阳性的肝癌患者具有潜在的免疫治疗作用。     

体外构建的HSP70—肝癌抗原肽诱导抗原肽特异性免疫反应

目的：研究体外构建的HSP70-肝癌抗原肽复合物诱导针对肝癌的特异性免疫反应能力,为该复合物的临床应用奠定基础。方法：在体外构建HSP70-肝癌抗原肽复合物,联合应用粒/巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）及白介素-4-（IL-4）直接从志愿者外周血中培养出DC;以HSP70、HSP70-肝癌抗原肽、抗原肽分别刺激DC,DC激活同源的T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,检测其杀伤72细胞和肝癌细胞系的能力。结果：HSP70-肝癌抗、抗原肽均可诱导CD8^ 的抗原肽特异性CTL,而前者的诱导效果更强。结论：体外构建的HSP70-抗原肽复合物具有免疫原性,HSP70可以增强抗原肽诱导特异性免疫反应的能力,HSP70-抗原肽复合物有可能作为肽疫苗用于临床肿瘤免疫治疗。     

白细胞介素15对人外周血单个核细胞抗肿瘤活性和T细胞受体谱型的影响

目的:探讨重组人白细胞介素15(rhIL-15)对人外周血单个核细胞(PBMC)抗肿瘤效应及T细胞受体(TCR)互补决定区3(CDR3)的影响.方法:应用LDH释放法检测rhIL-15作用前后PBMC对人急性髓系白血病细胞KGla的杀伤活性.分别以Jurkat和Raji细胞作为阳性和阴性对照.建立TCB CDR3基因扫描技术,并用其检测rhIL-15作用前后5名健康个体T细胞克隆表型.结果:rhIL-15作用后PBMC对KG1a细胞的杀伤活性较rhIL-15作用前明显增强(P<0.05).基因扫描显示5名健康个体TCR CDR3谱型均呈高斯分布,各家族CDR3表达频率接近,但呈现不同的多态性和长度分布.rhIL-15作用前后5名健康个体T细胞克隆表型无明显变化.结论:rhIL-15能显著提高PBMCs的抗肿瘤效应,并不改变T细胞的克隆表型.     

057 辅助性T淋巴细胞在抗肿瘤免疫反应中的作用

机体抗肿瘤免疫反应中起重要作用的是细胞免疫,近年来辅助性T淋巴细胞在抗肿瘤免疫反应中的作用越来越为人们所重视.Th细胞不仅可以分泌细胞因子调控肿瘤免疫,而且具有免疫记忆和直接杀伤肿瘤细胞的作用,随着一系列被Th细胞识别的肿瘤抗原被鉴定出来,人们对于Th细胞在抗肿瘤免疫反应中的作用有了进一步的认识.本文综述了近年来Th抗肿瘤作用机理及Th细胞表位研究进展.     

IL－2基因修饰人骨肉瘤细胞的制备及骨肉瘤患者IL－2和sIL－2R测定

目的ＩＬ－２基因修饰人骨肉瘤细胞的制备及骨肉瘤患者ＩＬ－２、ｓＩＬ－２Ｒ水平测定。方法用逆转录病毒载体将人ＩＬ－２基因插入人骨肉瘤细胞系制备成ＩＬ－２基因修饰骨肉瘤细胞；用放射免疫法及ＥＬＩＳＡ法检测骨肉瘤患者血清内ＩＬ－２、ｓＩＬ－２Ｒ水平。结果经Ｇ４１８筛选和ＰＣＲ鉴定后制备成功人骨肉瘤ＩＬ－２基因修饰细胞，并证实其有分泌ＩＬ－２功能，用ＭＴＴ法测得其培养上清中ＩＬ－２表达量为每１ｘ１０５细胞２４小时５０－８００ｕ。骨肉瘤患者免疫功能调查发现其血清ＩＬ－２水平明显低于正常，而ｓＩＬ－２Ｒ则明显高于正常，术后两者可逐渐正常。结论　制备成功ＩＬ－２基因修饰骨肉瘤细胞并发现骨肉瘤患者ＩＬ－２水平低下，为进行骨肉瘤基因治疗创造条件。