HRM法检测结直肠癌组织KRAS基因密码子12和13点突变

目的 建立HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突变的方法 .方法 采用HRM法对含不同比例KRAS基因突变型质粒的系列混合样本进行检测,以评价其灵敏度.应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况,并与直接测序法的结果 进行比较分析.结果 HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解,即可获得检测结果 .HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10%的突变,其检测灵敏度达10%.HRM法从60份大肠癌患者组织标本中,检出17份KRAS基因密码子12或13突变(28.3%);直接测序法检出15份(25.0%)突变,2份未检出KRAS基因突变.HRM法检测的敏感度为100%(15/15),特异度为96%(43/45).结论 HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时,具有操作简便、快速、灵敏,单管避免污染等优点,完全符合临床个体化治疗的要求,值得推广.     

利用SELDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱技术建立肺腺癌诊断模型

目的:寻找肺腺癌患者血浆(清)蛋白特异性生物标志物,用最佳的标志蛋白组合建立肺腺癌诊断模型,并探讨其用于肺腺癌筛查的可行性.方法:应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术及CM10芯片,检测45例肺腺癌患者和40例正常人血清蛋白质指纹图谱,用Biomark Wizrd和Biomark Patterns Software软件对结果进行分析,建立肺腺癌诊断模型:双盲法分析另外19例肺腺癌和20例正常人血清的SELDI质谱数据,验证该模型诊断肺腺癌的准确度.结果:肺腺癌患者和正常人血清蛋白质指纹图谱间有31个差异蛋白(P<0.05),其中以分子量为11.66 kD的蛋白在两组血清中的差异最为显著(P<10-7),该蛋白对诊断肺腺癌有很强的敏感性和特异性;软件自动筛选出分子量为11.66 kD的标志蛋白为主根结点,联合3882.9、4673.2、3158.2和2047.2等4个标志蛋白建立了最佳的肺腺癌诊断模型,对肺腺癌诊断(盲法)的敏感性为84.2%(16/19),特异性为90.0%(18/20).结论:SELDI-TOF-MS技术建立的肺腺癌血清检测法,快速、简单、特异和敏感,为肺腺癌诊断和筛查提供了一个可行的途径和方法.     

GST-PPARγC1原核表达载体的构建、表达及抗GST-PPARγC1多克隆抗体的制备

目的 在大肠杆菌中表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(PPARγC1)与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗PPAR γC1的多克隆抗体.方法 从肝癌细胞系Hep G2提取总RNA,用RT-PCR扩增出PPAR γ C1 cDNA的编码序列,克隆人表达载体pGEX-T-1中,重组载体在酶切鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-PPARγC1蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.通过亲和层吸法纯化表达的GST-肿ARγC1融合蛋白,并以此为抗原制备多克隆抗体.Westernblotting检测重组抗原的免疫活性.结果 经测序、酶切鉴定证明,PPARγC1基因已正确插入到pGEX-T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为000的融合蛋白.Western blotting鉴定所制备的多克隆抗体可以与PPARγC1特异性结合.结论 PPARγC1片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体,为检测PPARγC1及其在其他组织中的表达提供了一种检测途径.     

人血清反应因子基因的原核表达及鸡卵黄多克隆抗体的制备

目的 在原核系统中表达人血清反应因子(serum response factor,SRF)基因,制备鸡卵黄抗SRF抗体并鉴定其特性.方法 构建SRF表达载体PGEX-T-2-SRF,并在大肠杆菌中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达.表达产物经谷胱甘肽-S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)亲和层析柱纯化后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)进行鉴定.用纯化的SRF免疫海蓝白母鸡,制备鸡抗SRF抗体.抗体的效价及特异性用蛋白质印迹技术进行测定和分析,免疫荧光鉴定其在心肌细胞中的定位.结果 构建的重组质粒PGEX-4T-2-SRF在大肠杆菌中得到高表达,诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清液中,纯化的SRF经SDS-PAGE鉴定呈单一条带.以纯化的SRF免疫制备了鸡抗SRF抗体.蛋白质印迹技术结果表明,该抗体可与原核表达的SRF特异性结合,抗体效价为1:5000.免疫荧光证实该抗体可以和心肌细胞的细胞核特异性结合.结论 在原核细胞中表达了SRF制备的鸡抗SRF的抗体对SRF能进行特异性结合.     

应用SELDI-TOF-MS技术筛选肺腺癌患者血清诊断标志物

目的 探讨肺腺癌患者及正常人血清中蛋白质质谱的不同,筛选出肺腺癌血清诊断标志物.方法 用WCX2蛋白芯片结合表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术,检测24例肺腺癌和10例正常人血清蛋白质谱,筛选出差异表达蛋白质.结果 本实验共检测到86个有效的蛋白质波峰,其中m/z位于分子质量2000～10 000的波峰有78个.筛选出m/z分子质量为8129.55,2022.18,3271.91,3933.44,3504.49,3811.71的6个血清肿瘤标志物.结论 SELDI-TOF-MS技术是寻找肺腺癌血清诊断标志物的有效工具.利用蛋白组学和生物信息学及相关技术,将有利于建立新的疾病诊断模式--蛋白质指纹图谱.     

肺癌EGFR基因突变"Web of Science"溯源

2004年4—5月，美国的两个研究小组在《新英格兰医学杂志》和《Science》上几乎同时发表的两篇关于“表皮生长因子（epidermal growth factor receptor．EGFR）基因突变预测TKI（tyrosine kinase inhibitor）治疗肺癌敏感性”的文章．吸引了肺癌研究领域所有学者的眼球．无数临床医生、基础研究人员为此孜孜不倦。转化性研究迅速使肺癌治疗观念向个体化分子靶向治疗过渡。在随后的短短两年间．全球各个著名肺癌研究团队发表的大量论文重复和充实了相关知识领域，使人们对靶向治疗的认识不断深化。与此同时．引申出越来越多令人着迷、引人探索也使人困惑的论题。     

儿童恶性骨肿瘤患者Th1/Th2亚群漂移的研究

儿童恶性骨肿瘤的发病率仅次于造血系统恶性肿瘤,其中成骨肉瘤约占儿童恶性肿瘤的5%。本病对手术及放化疗的效果不佳,预后极差[1]。随着肿瘤免疫学的发展,以细胞因子为核心的免疫治疗逐渐被临床所接受。根据分泌细胞因子的不同,可将辅助性Ｔ淋巴细胞亚群分为辅助性亚群1(Ｔｈ1)和辅助性亚群2(Ｔｈ2)两个亚群。Ｔｈ1亚群与Ｔｈ2亚群平衡状态的失调,必然导致细胞因子网络的紊乱,从而影响细胞免疫和体液免疫的功能。通过检测细胞因子的水平,可以反映Ｔｈ1/Ｔｈ2的平衡状态[2]。恶性骨肿瘤患儿体内Ｔｈ1/Ｔｈ2状态尚未见报道。本实验对此进行了…     

靶向DAL-1基因的shRNA表达载体的构建与鉴定

目的：建立DAL-1稳定抑制的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞实验模型．方法：构建靶向DAL-1的shRNA表达载体转染NSCLC细胞株，筛选出阳性克隆，在mRNA和蛋白质水平鉴定其抑制效率，最终得到DAL-1稳定抑制的细胞株．结果：通过双酶切鉴定和测序鉴定构建的shRNA表达载体序列正确，T4表达载体在mRNA和蛋白质水平能有效抑制DAL-1的表达，抑制率分别为（87．4±2．0）％和（82．7±2．1）％．结论：成功设计并构建了靶向DAL-1的shRNA表达载体，建立了DAL-1稳定抑制的NSCLC细胞株，为进一步研究DAL-1在NSCLC细胞中的作用提供了实验模型．     

肝癌介入治疗护理

目的:探讨经肝动脉化疗栓塞治疗肝癌的护理措施。方法:对8例肝癌患者介入治疗护理。结果:8例患者护理满意。结论:运用科学的方法对患者进行有效的护理是非常重要的。