树突状细胞对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究

目的：研究人外周血树突细胞（dendriticcell,DC）对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞的影响,以期获得具有抗原特异性杀伤功能的细胞毒活性细胞,并分别对CIK、LAK和CD3AK的杀伤效果进行比较.方法：采用某一肺腺癌肿瘤患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMNC）,经体外诱导分别扩增出CIK、LAK、CD3AK和DC细胞,再将靶细胞抗原孵育过的DC同三种细胞共同培养,通过镜下动态观察CIK联合DC对癌性胸腔积液中肿瘤细胞的杀伤活性,并利用MTT法检测CIK联合DC体外杀伤人肺腺癌细胞系（SPC-A1）的活性,同时比较CIK、LAK和CD3AK三种细胞的体外杀瘤活性.结果：CIK-ADC的杀伤活性最强为92.3%,明显高于单纯CIK的59.7%和DC-CIK的79.8%,（P值分别为0.025和0.042）,提示CIK A-DC细胞对肿瘤杀伤的特异性.而DC-CIK的杀伤活性为79.8%,也高于单纯CIK对照组59.7%,P=0.034,说明DC具有明显增强CIK细胞杀瘤活性的功能.同时,不论从单纯CIK、LAK、CD3AK细胞毒活性,或是从三种细胞联合DC的细胞毒活性比较,CIK细胞较后两种细胞都具有更强的杀伤活性,P值分别为0.038和0.022.联合DC的自体CIK细胞体外杀瘤活性显著增强,CIK细胞的杀伤活性显著高于LAK、CD3AK两种细胞.结论：DC可明显提高自体CIK细胞的体外杀瘤活性.     

甲状腺癌组织差异表达cDNA消减文库的构建与鉴定

目的：应用抑制性消减杂交技术，构建人甲状腺癌与正常甲状腺差异表达的cDNA消减文库。方法：分别从甲状腺癌及正常甲状腺组织中提取总RNA，应用高效、灵敏的抑制性消减杂交技术，构建成功cDNA消减文库，再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果：构建成功具有高消减效率的人甲状腺癌组织cDNA消减文库，文库扩增得到了400个克隆，随机挑取50个制备质粒，酶切分析均得到50～400bp大小插入片段，这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段，结论：人甲状腺癌组织cDNA消减文库的建立为进一步克隆甲状腺癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

The Establishment of Gene Gun-Mediated Human GM-CSF Gene Transfection System and It′s Stable Expression in Tumor Cells

目的：建立基因枪介导的基因转移系统，为基因修饰的肿瘤细胞疫苗研究奠定实验基础。方法：采用基因枪转导的方法，将真核表达质粒（pcDNA3.1 GM-CSF）转导入人胃癌细胞株（SGC），经G418筛选获得阳性克隆（SGC-GM-CSF），通过RT-PCR方法鉴定，重组载体已整合到胃癌细胞的基因组中。结果：SDS-PAGE和Western blot分析的SGC-GM-CSF上清液结果显示rhGM-CSF主带在30kD左右，SGC-GM-CSF在体外长期培养中保持稳定分泌，分泌量达到24h平均247ng/10^6cell。结论：建立的基因枪介导的基因转移系统安全、有效，为应用于肿瘤基因治疗提供了实验基础。     

GSTT1和GSTM1基因缺失多态与胃癌易感性

目的　探讨与致癌物解毒有关的谷胱甘肽转硫酶 (GST) T1和 M1基因遗传缺失多态与胃癌易感性的关系。方法　采用病例对照分子流行病学研究方法 ,以 PCR技术对福建省福州市 92例胃癌病例和 92例正常对照者的 GSTT1和 GSTM1基因型进行检测。结果　 GSTT1基因在胃癌病例和对照组中的缺失率分别为 5 3.3%和41.3% ,差异无显著性 (x2 =2 .6 4,P=0 .10 4)。而 GSTM1基因在胃癌病例和对照组中的缺失率分别为 6 9.6 %和5 2 .2 % ,差异具有显著性 (x2 =5 .84,P=0 .0 15 7)。携带 GSTM1(- )基因型者发生胃癌的危险性是携带 GSTM1( )基因型者的 2 .1倍 (OR=2 .10 ,95 % CI=1.10～ 4.0 1)。联合分析表明 ,GSTT1和 GSTM1基因之间可能存在联合作用 ,携带 GSTT1(- )和 GSTM1(- )基因型者发生胃癌的危险性高于携带 GSTT1( )和 GSTM1( )基因型者 (OR=4.6 7,95 % CI=1.5 5～ 14.41)。结论　 GSTM1基因缺失可能是胃癌发病的危险性因素之一     

靶向乳腺癌干细胞DC瘤苗的核酸抗原制备

摘要 目的：应用无血清培养基细胞球培养法富集MCF-7乳腺癌干细胞,制备乳腺癌干细胞mRNA核酸抗原,为制备靶向乳腺癌干细胞树突细胞瘤苗奠定基础。方法：应用无血清培养基悬浮培养法富集MCF-7乳腺癌细胞,经单克隆形成、表面标志检测、NOD-SCID小鼠成瘤等实验对其肿瘤干细胞特性进行鉴定后,利用T7 mMESSAGE mMACHINE试剂盒进行mRNA体外扩增。结果：乳腺癌细胞MCF-7在无血清培养基中可形成悬浮状细胞球,其中具有CD44+CD24-表面标志的细胞约占90.16%。该细胞亚群具有较贴壁细胞更强的克隆形成能力和低剂量体内成瘤能力。细胞总RNA经体外扩增获得的mRNA,可作为核酸抗原。结论：应用无血清悬浮细胞球培养法可以获得高含量乳腺癌干细胞。通过体外扩增方法获得该细胞亚群的mRNA,可作为肿瘤核酸抗原,为下一步制备靶向乳腺癌干细胞的树突细胞瘤苗奠定了基础。     

人Egr-1启动子调控的自杀基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞株中的放射诱导表达

[目的]构建由人Egr-1放射诱导性启动子调控的自杀基因靶向性真核表达载体,并转染人鼻咽癌细胞株CNE,比较射线诱导前后自杀基因在鼻咽癌细胞中的表达情况。[方法1根据Genebank数据库提供的人Egr—1启动子基因序列,设计-对引物克隆人Egr-1启动子,采用PCR、酶切、连接等分子生物学技术,构建pcDNA3．1（＋）-Egr-1-CD重组质粒表达载体,并利用脂质体转染方法转染人CNE细胞株,经G418筛选后获得阳性细胞克隆。RT—PCR分析鉴定0、5、10、15、20Gy放射剂量进行6MVX线照射对CD基因表达的影响。f结果1经PCR、酶切、测序等证实了pcDNA3．1（＋）-Egr．1．CD重组靶向性质粒表达载体构建成功,G418筛选所得到的CNE细胞阳性克隆经不同放射剂量的诱导后,RT—PCR结果显示体外放射线照射可显著提高CNE细胞中CDmRNA的表达水平,在10Gy及15Gy组CDmRNA的表达水平明显增高,尤以15Gy组CDmRNA的表达水平最高,在20Gy组CDmRNA的表达水平反而下降。[结论]pcDNA3．1（＋）-Egr-1-CD重组质粒表达载体构建成功,并成功转染人鼻咽癌细胞株．建立了基因表达与放射的剂量效应关系．为后续的临床应用研究奠定基础．     

巢式RT-PCR对肺癌外周血中微转移灶的检测和半定量测定

目的对肺癌外周血中微转移灶的检测和半定量测定。方法以CK-19为标记,采用巢式RT-PCR和半定量方法对肺癌患者外周血中微转移灶的检测,比较治疗前后外周血中癌细胞数的相对变化。结果60例肺癌中有29例CK-19阳性,18例健康人中,仅1例检测出CK-19阳性,7例肺良性疾病患者有2例为CK-19阳性。实验组CK-19阳性率48%(29/60)与对照组12%(3/25)相比有极显著差异(P<0.01)。2例肺癌患者化疗前相对癌细胞数分别为25和16个,经1周期化疗后,相对癌细胞数分别为5和1个。结论以CK-19为标记,采用巢式RT-PCR方法检测肺癌患者外周血中的癌细胞有较高敏感性和特异性,半定量RT-PCR法,能早期反映外周血中癌细胞数的相对变化情况,有助于对临床疗效及早做出评价。     

NK细胞高选择性扩增及其对移植瘤生长抑制作用

[目的]建立一种NK细胞体外选择性高效扩增的实验体系,观察其体内的抗肿瘤活性.[方法]以干细胞培养基(SCGM)为培养基,在低剂量IL-2(100 U/m1)联合14 mer肽TKD(TKDNNLLGRFELSG,aa450-463)(2μg/ml)的培养条件下,从人外周血PBMC中高效扩增获得CD3-CD56+NK细胞,并建立肝癌裸鼠移植瘤模型,观察NK细胞在体内的抗肿瘤活性.[结果]建立了一种高效的从人外周血PBMC中选择性扩增NK细胞的体系,该NK细胞对表面表达HSP70的肝癌移植瘤模型具有显著的抗肿瘤作用.[结论]经过14 mer肽TKD激活的NK细胞对表面表达HSP70的肿瘤具有很强的溶解活性.     

Toll样受体-4表达对树突状细胞表型及功能的影响

目的:探讨Toll样受体-4(TLR-4)表达对树突状细胞(DC)表型及功能的影响及其机制.方法:以构建的含有TLR-4全基因序列的pcDNA3.1质粒载体为模板,通过mMESSAGE mMACHINE T7 Kit体外转录获得TLR-4 mRNA,并采用脂质体法将其转染健康人外周血PBMC来源的DC,用流式细胞术检测鉴定转染后DC表面功能性分子的表达及DC体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分泌细胞因子的能力.结果:成功构建人TLR-4-pcDNA3.1质粒载体;体外扩增成功人TLR-4和EGFP mRNA片段.TLR-4 mRNA转染后的DC表面趋化因子CCR7及功能性分子HLA-DR的表达显著高于control mRNA转染DC、转染前成熟DC[CCR-7:(42.4±4.93)％ vs (20.1±3.09)％、(17.1±4.33)％,P＜0.05;HLA-DR:(62.1±7.23)％ vs(17.7±6.01)％、(25.8±4.16)％,P＜0.05],同时转染后的DC体外诱导CTL分泌IFN-γ细胞因子的能力强于control mRNA-DC、空载转染DC诱导的CTL及加入DC前CTL[(66.5±3.58)％ vs (41.1±4.27)％、(37.9±2.96)％、(3.2±2.03)％,P＜0.05].结论:TLR-4 mRNA转染DC可显著增强DC的功能,提高了DC抗原提呈及诱导CTL的能力,为增强DC疫苗抗肿瘤效应提供实验依据.     

人肺腺癌细胞系SPC-A1 mRNA修饰的树突状细胞体外抗肿癌免疫反应

目的探讨人肺腺癌细胞系SPC-A1mRNA转染的人外周血树突细胞(dendriticcell,DC)疫苗在体外诱导特异性抗肿瘤免疫反应的能力。方法从健康人外周血分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC),在白细胞介素-4(interleu-kin-4,IL-4)和人粒细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,GM-CSF)作用下诱导培养成DC。体外扩增、转录的方法获得人肺腺癌细胞系SPC-A1mRNA,并利用脂质体转染的方法导入DC,流式检测转染后DC表面标记,并与淋巴细胞共孵育,激活T淋巴细胞,MTT法检测其对人肺腺癌细胞的特异性杀伤活性。结果转染后的DC特异性表面标志及功能相关分子表达显著升高(CD8680·32±1·60;HLA-DR86·03±2·58;CD8326·97±1·62),诱导的特异性杀伤反应能力与经肿瘤细胞裂解物负载的DC、未经转染的DC及空白淋巴细胞组相比显著提高(80·34±2·71,P<0·01)。结论人肺腺癌细胞系SPC-A1mRNA转染的DC疫苗体外诱导的特异性抗肿瘤免疫能力显著增强。