抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究

[目的]探讨抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导CIK（cytokine induced killer）的杀伤作用。[方法]联合应用粒/巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）及白介素-4（IL-4）从外周血单个核细胞中培养DC，用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC，流式细胞仪检测致敏前后DC表型的变化，用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC诱导CIK，用MTT法检测淋巴细胞的增殖及原致敏DC诱导CIK对SGC的杀伤效应。[结果]①利用GM-CSF及IL-4可从外周血单个核细胞中获取DC，肿瘤抗原可促进DC的成熟，肿瘤抗原致敏可促进DC成熟，细胞表面分子HLA-DR、CD86、CD86升高，CD14下降。②混合淋巴细胞反应提示成熟的DC可促进CIK细胞增殖。③SGC肿瘤抗原致敏DC诱导CIK对胃癌细胞SGC有特异性的杀伤作用，随着效靶比的升高，杀伤效应随之增强。[结论]抗原致敏的DC可通过诱导特异性CIK细胞及促进CIK细胞增殖两方面显著提高CIK细胞的杀瘤效应。     

放射线诱导hEgr-1-CD对鼻咽癌CNE放射增敏作用的研究

目的 研究放射线诱导hEgr-1-CD自杀基因前药系统对鼻咽癌CNE细胞株放射增敏作用。方法 将pcDNA3.1（＋）Egr-1-CD利用脂质体转染的方法 转染入鼻咽癌细胞株,给予不同剂量的X线照射观察基因表达与放射的剂量效应关系,观察不同的放射线及不同剂量的前药对鼻咽癌细胞的杀伤效应。结果 电离辐射可诱导增强自杀基因阳性鼻咽癌CNE细胞株中CD基因的表达,电离辐射与前药5-Fc的联合应用大大增强了对自杀基因阳性细胞的杀伤作用,其杀伤作用大于单独自杀基因前药系统和单独照射。结论 hEgr-1-CD自杀基因前药系统对鼻咽癌CNE细胞株有放射增敏作用,其与放射联合应用对CNE细胞有明显的协同杀伤作用。     

人胃印戒细胞癌组织差异表达基因克隆的研究

目的：分离胃印戒细胞癌组织差异表达基因。探讨人胃印戒细胞癌发生的分子机制。方法：采用抑制性消减杂交技术(SSH)．构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库；随机挑选部分阳性克隆测序，与GenBank中的已知序列进行基因同源性分析，并进一步探讨基因功能。结果：成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，并分离出多个差异表达基因片段：其中1条与染色体序列相似，可能代表未知的新基因序列，已被GenBank接收(注册号：CN446913)；其他多为已知的肿瘤相关基因的部分片段。结论：1)SSH技术是分离差异表达基因的有效方法；2)胃印戒细胞癌的发生发展与多种基因表达异常有关。     

5-Aza-CdR 联合EBNA1-DC 疫苗诱导的淋巴细胞对鼻咽癌C666-1细胞的杀伤作用

目的：探讨EB病毒核抗原1（EBNA1） mRNA修饰的DC（EBNA1-DC）诱导的淋巴细胞联合甲基化抑制剂5-Aza-CdR对鼻咽癌C666-1细胞的杀伤作用。方法：以构建的EBNA1-pCDNA3.1质粒为模板,体外转录获得EBNA1 mRNA,通过脂质体转染至健康人外周血来源DC,构建EBNA1-DC疫苗。流式细胞术检测转染后DC表型及5-Aza-CdR 处理后的C666-1 细胞凋亡情况。实时无标记动态细胞分析技术检测EBNA1-DC 疫苗诱导的淋巴细胞联合5-Aza-CdR 的特异性抗肿瘤活性。结果：转染EBNA1 mRNA 后EBNA1-DC 表面EBNA1 阳性率为（59.3±5.85）%,HLA-DR 的表达与未转染DC 相比显著升高[（84.9±5.5）% vs（68.0±5.8）%,P=0.026],CD80 的表达也显著升高[（88.2±3.9）% vs （61.1±4.4）%,P=0.015]。低剂量5-Aza-CdR 处理后的C666-1细胞凋亡情况与未处理的细胞相比无显著差异。经低浓度5-Aza-CdR 预处理的C666-1细胞中IRF7基因表达与未处理的细胞相比显著升高（P=0.000 1）。与空载的DC相比,EBNA1-DC诱导的淋巴细胞对EBV 阳性表达的C666-1细胞具有更强的特异性杀伤活性（P=0.049）;经低浓度5-Aza-CdR 预处理的C666-1 细胞对EBNA1-DC 诱导的特异性免疫杀伤更敏感（P=0.019）。结论：5-Aza-CdR 与EBNA1-DC疫苗联合可显著增强对C666-1细胞的特异性免疫杀伤,本研究为开拓以mRNA为基础的DC疫苗及其在临床综合治疗中的应用转化提供前期研究基础。     

人外周血树突细胞的分离与提纯

目的 从人外周血中分离、培养及鉴定树突细胞（ＤＣ）。方法 从正常人外周血分离获得单个核细胞,培养２小时后,取会细胞,在无血清培养基中加入不同的细胞在子,于２的第１,６,８天对形态,表型和功能分擀行测定,并在光镜、电镜下观察ＤＣ的纯度与得率。结果 体外培养６～８天可获得高纯度大量的ＤＣ,较高表达ＨＬＡ ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８３和ＣＤ８６,能强烈激发同种慢体Ｔ淋巴细胞增殖。结论 上述方法可以从人外周血     

树突状细胞对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究

目的:研究人外周血树突细胞(dendriticcell,DC)对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞的影响,以期获得具有抗原特异性杀伤功能的细胞毒活性细胞,并分别对CIK、LAK和CD3AK的杀伤效果进行比较。方法:采用某一肺腺癌肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNC),经体外诱导分别扩增出CIK、LAK、CD3AK和DC细胞,再将靶细胞抗原孵育过的DC同三种细胞共同培养,通过镜下动态观察CIK联合DC对癌性胸腔积液中肿瘤细胞的杀伤活性,并利用MTT法检测CIK联合DC体外杀伤人肺腺癌细胞系(SPC-A1)的活性,同时比较CIK、LAK和CD3AK三种细胞的体外杀瘤活性。结果:CIK-A-DC的杀伤活性最强为92.3%,明显高于单纯CIK的59.7%和DC-CIK的79.8%,(P值分别为0.025和0.042),提示CIK-A-DC细胞对肿瘤杀伤的特异性。而DC-CIK的杀伤活性为79.8%,也高于单纯CIK对照组59.7%,P=0.034,说明DC具有明显增强CIK细胞杀瘤活性的功能。同时,不论从单纯CIK、LAK、CD3AK细胞毒活性,或是从三种细胞联合DC的细胞毒活性比较,CIK细胞较后两种细胞都具有更强的杀伤活性,P值分别为0.038和0.022。联合DC的自体CIK细胞体外杀瘤活性显著增强,CIK细胞的杀伤活性显著高于LAK、CD3AK两种细胞。结论:DC可明显提高自体CIK细胞的体外杀瘤活性。     

细胞色素P450 2E1基因与胃癌易感性关系

目的：探讨与致癌物亚硝胺代谢激活有关的细胞色素P450（CYP）2E1基因多型性与胃癌易感性关系。方法：采用病例对照分子流行病学研究方法，以聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）技术，对福建省长乐市92例胃癌病例和92例正常对照的CYP2E1基因型进行检测。结果：在病例组和对照组中，RsaI识别的野生型（C1／C1）基因频率分别为66．3％和48．89％；DraI识别的野生型（CC）基因频率分别为57．6％和41．3％，差异均具有显著性（P＜0．05），即具有RsaI识别的C1／C1基因型或DraI识别的CC基因型个体，患胃癌的危险性大（OR值分别为2．06和1．93）。联合分析表明，这两个位点的基因型存在某种程度的联合作用（P＜0．05）。结论：CYP2E1基因多型性可能与胃癌易感性有关。     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人粒细胞 巨噬细胞集落刺 激因子(GM CSF)基因的重组腺病毒载体,为进 一步研究GM CSF基因在肿瘤基因治疗中的应 用提供实验基础。方法:采用PCR方法,从重 组质粒pcDNA3.1 GM CSF扩增出GM CSF 基因片段,通过穿梭质粒pShuttle,将带有CMV 启动子的目的片段克隆入Adeno X腺病毒 DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转 染HEK293细胞,经包装扩增后,获得重组腺 病毒Adeno X GM CSF,PCR鉴定,ELISA法 检测表达产物。结果:含GM CSF基因的重组 腺病毒Adeno X GM CSF构建成功,经PCR鉴 定和DNA测序等证实了其正确性,重组腺病毒 上清液中GM CSF表达量达26ng/mL。结论: 含GM CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

巢式RT-PCR对肺癌外周血中微转移灶的检测和半定量测定

目的对肺癌外周血中微转移灶的检测和半定量测定。方法以CK-19为标记,采用巢式RT-PCR和半定量方法对肺癌患者外周血中微转移灶的检测,比较治疗前后外周血中癌细胞数的相对变化。结果60例肺癌中有29例CK-19阳性,18例健康人中,仅1例检测出CK-19阳性,7例肺良性疾病患者有2例为CK-19阳性。实验组CK-19阳性率48%(29/60)与对照组12%(3/25)相比有极显著差异(P<0.01)。2例肺癌患者化疗前相对癌细胞数分别为25和16个,经1周期化疗后,相对癌细胞数分别为5和1个。结论以CK-19为标记,采用巢式RT-PCR方法检测肺癌患者外周血中的癌细胞有较高敏感性和特异性,半定量RT-PCR法,能早期反映外周血中癌细胞数的相对变化情况,有助于对临床疗效及早做出评价。     

Expression of RHGM-CSF gene in eukaryocyte by lipofection

Recombinant human GM-CSF has been widely used in clinic since it was cloned in 1985.[1] It is not only an effective hematopoiesis factor, but also a cytokines that can stimulate the efficient and persistent antitumor activity in the whole body.[2] At present, recombinant hGM-CSF gene has been expressed successfully in E. coil and used in clinic. Because of the product's purification and lack of sugar chain, it is more significant to produce nearly natural hGM-CSF with sugar chain conside…