长期传代人脐带间充质干细胞的特性及功能

目的：探讨传至10 代（P10）的人脐带来源间充质干细胞（P10-hUC-MSC）的生物学特性及功能。方法：人脐带来源于厦门弘爱医院（伦理批号：HAXM-MEC-20201012-037-01）,分离、收集、培养hUC-MSC 并传代培养,收集P1-、P10-hUC-MSC, FCM检测hUC-MSC 表型,细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法及FCM法检测终末期细胞衰老与凋亡情况,秋水仙碱处理检测细胞染色体稳定性,体外成脂、成骨诱导实验检测其多向分化能力,以不同比例与外周血单个核细胞（PBMC）混合培养后FCM检测T细胞亚群及表型变化。结果：成功分离和培养的P10-hUC-MSC与P1-hUC-MSC 的表型相似,表现为CD45、CD34、HLA-DR表达阴性而CD105、CD90 阳性率 95%。终末期的P1-hUC-MSC 和P10-hUC-MSC 均表现出β-半乳糖苷酶表达阳性和早期凋亡特征,细胞染色体核型一致且保持稳定,未发生转化现象。P1-、P10-hUC-MSC在体外都可被诱导分化成脂肪、成骨细胞。P10-hUC-MSC与PBMC 以1∶1 混合培养7 d 后,可显著上调CD4+/CD8+ T细胞比值、CD4+ Treg 细胞比例和PD-1表达（均P<0.01）。结论：长期传代的P10-hUC-MSC仍然保持其生物学特性和安全性,并具备多向分化能力及免疫调节能力,这为最大限度发挥hUC-MSC的临床放疗损伤修复与预防作用提供了前期实验依据和指导。     

人IL-15/GM-CSF融合基因的克隆及序列测定

目的：构建一种可能具有双重活性、增加或增强某种新生物活性的融合因子,为寻找新的有效的细胞因子探索新的途径。方法：利用引物的合理设计、基因重组及PCR突变技术,构建由Gly-Gly-Ser连接臂连接的IL－15／GM－CSF融合基因,结果：经Bg1 Ⅱ酶切鉴定和序列测定证实,上述融合基因已克隆至真核表达载体pcDNA3．0。结论：E要用基因克隆及PCR突变技术,利用pcDNA3、构建了pcDNA3.0GM-CSF/IL-15融合基因。     

CIK细胞联合常规治疗对肾透明细胞癌患者的临床疗效

目的:探讨DC-CIK细胞治疗肾透明细胞癌临床疗效及治疗次数对患者预后的影响.方法:回顾性分析2004年1月至2011年6月在福建省肿瘤医院诊疗的100例肾透明细胞癌患者,其中63例在福建省肿瘤生物治疗重点实验室进行自体DC-CIK细胞免疫治疗联合常规治疗为DC-CIK细胞治疗组,其余37例未经DC-CIK细胞治疗为对照组,比较两组患者的5年DFS和OS.治疗组按照DC-CIK细胞治疗疗程数分成≤3个疗程组及＞3个疗程组,分析DC-CIK细胞治疗疗程数对肾透明细胞癌患者5年DFS和OS的相关性.结果:DC-CIK细胞治疗组患者5年OS较对照组明显提高(81.05％ vs 60.29％,P＜0.05),但5年DFS无显著性差异(P＞0.05);DC-CIK细胞治疗疗程数＞3个的患者5年OS较对照组明显提高(P＜0.05),但5年DFS无显著性差异(P＞0.05).结论:自体DC-CIK细胞回输联合常规治疗手段治疗肾透明细胞癌更有生存优势,且DC-CIK细胞治疗疗程数与肾透明细胞癌患者的预后密切相关.     

人热休克蛋白70的原核表达和纯化的实验研究

目的在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70基因并纯化表达产物。方法以人HSP0 cDNA为模板,采用PCR方法进行扩增,将PCR产物克隆到表达载体pET30a上,将重组质粒pET30a-HSP70转化大肠杆菌BL21上,经IPTG诱导后,表达产物进行SDS-PAGE及Western blot验证并纯化。结果应用PCR方法扩增出约1900bp的目的片段;经酶切鉴定和DNA测序证实,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-30a上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE,发现在分子量约为70kD处有蛋白表达,Western blot证实其为目的蛋白,纯化后的HSP70纯度达到90%以上。结论在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70蛋白并且经过纯化,为研究HSP70的结构、功能及临床应用提供了必要条件。     

应用PCR-SSCP银染技术分析胃癌p53基因的点突变

目的 分析胃癌中p53基因第5－8外显子点突变的发生及其意义。方法 应用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）和银染技术，对40例胃良性疾病和30例胃癌标本中p53基因第5－8外显子的点突变情况进行检测。结果 40例胃良性疾病均无点突变发生，30例胃癌中有12例发生p53基因的点突变，突变率为40．00％（12／30）。结论 p53基因突变与胃癌的发生密切相关；PCR－SSCP银染技术不仅灵敏安全，而且简便、快速、重复性好，可用于临床的基因诊断。     

小鼠肠癌HSP70多肽复合物的纯化及其抗肿瘤免疫效应

目的:应用AKTA-purifier100液相层析系统,建立分离和纯化热休克蛋白70(HSP70)多肽复合物的方法,并观察其抗肿瘤免疫保护效应。方法:采用DE-AE-Sepharose离子交换层析和ADP-Ag-arose亲和层析,从热处理的BALB/c鼠源性结肠癌细胞(CT26)制备裂解液中分离、纯化HSP70多肽复合物,并通过主动免疫保护实验观察其抗肿瘤免疫效应。结果:纯化蛋白经鉴定为相对分子质量70×103左右的HSP70多肽复合物;平均1g湿重肿瘤细胞可获得63.63μgHSP70多肽复合物;HSP70主动免疫的小鼠可抵抗CT26细胞的攻击。结论:用此层析法可分离纯度较高的HSP70,并可诱导明显的抗肿瘤免疫保护效应。     

CIK与DC细胞联合治疗145例晚期恶性实体瘤

目的 研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和树突状细胞(DC)联合治疗晚期肿瘤. 方法 从外周血分离单个核细胞,体外经GM-CSF和白细胞介素4(IL-4)诱导产生DC细胞,淋巴细胞经干扰素γ(IFN-γ)、IL-2、CD3单抗和IL-1α体外诱导产生CIK细胞,采用流式细胞术检测CIK的表型,并回输患者进行治疗,至少接受3次治疗. 结果 82例可评价病灶的患者中,3例完全缓解(CR),7例部分缓解(PR);31例不可评价病灶的患者中,7例患者胸腹水消失,与治疗前相比,治疗后患者CD3 和 CD8 明显升高(P＜0.05). 结论 CIK细胞治疗晚期恶性实体瘤有一定的临床疗效,为该类患者的治疗提供一种有效的免疫治疗手段.     

抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究

[目的]探讨抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导CIK（cytokine induced killer）的杀伤作用。[方法]联合应用粒/巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）及白介素-4（IL-4）从外周血单个核细胞中培养DC，用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC，流式细胞仪检测致敏前后DC表型的变化，用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC诱导CIK，用MTT法检测淋巴细胞的增殖及原致敏DC诱导CIK对SGC的杀伤效应。[结果]①利用GM-CSF及IL-4可从外周血单个核细胞中获取DC，肿瘤抗原可促进DC的成熟，肿瘤抗原致敏可促进DC成熟，细胞表面分子HLA-DR、CD86、CD86升高，CD14下降。②混合淋巴细胞反应提示成熟的DC可促进CIK细胞增殖。③SGC肿瘤抗原致敏DC诱导CIK对胃癌细胞SGC有特异性的杀伤作用，随着效靶比的升高，杀伤效应随之增强。[结论]抗原致敏的DC可通过诱导特异性CIK细胞及促进CIK细胞增殖两方面显著提高CIK细胞的杀瘤效应。     

树突状细胞对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究

目的:研究人外周血树突细胞(dendriticcell,DC)对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞的影响,以期获得具有抗原特异性杀伤功能的细胞毒活性细胞,并分别对CIK、LAK和CD3AK的杀伤效果进行比较。方法:采用某一肺腺癌肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNC),经体外诱导分别扩增出CIK、LAK、CD3AK和DC细胞,再将靶细胞抗原孵育过的DC同三种细胞共同培养,通过镜下动态观察CIK联合DC对癌性胸腔积液中肿瘤细胞的杀伤活性,并利用MTT法检测CIK联合DC体外杀伤人肺腺癌细胞系(SPC-A1)的活性,同时比较CIK、LAK和CD3AK三种细胞的体外杀瘤活性。结果:CIK-A-DC的杀伤活性最强为92.3%,明显高于单纯CIK的59.7%和DC-CIK的79.8%,(P值分别为0.025和0.042),提示CIK-A-DC细胞对肿瘤杀伤的特异性。而DC-CIK的杀伤活性为79.8%,也高于单纯CIK对照组59.7%,P=0.034,说明DC具有明显增强CIK细胞杀瘤活性的功能。同时,不论从单纯CIK、LAK、CD3AK细胞毒活性,或是从三种细胞联合DC的细胞毒活性比较,CIK细胞较后两种细胞都具有更强的杀伤活性,P值分别为0.038和0.022。联合DC的自体CIK细胞体外杀瘤活性显著增强,CIK细胞的杀伤活性显著高于LAK、CD3AK两种细胞。结论:DC可明显提高自体CIK细胞的体外杀瘤活性。     

细胞因子裸质粒DNA的抗肿瘤研究

目的 探讨瘤体内直接注射细胞因子裸质粒DNA(pcDNA3．1-GM-CSF和pcDNA3．0-IL-15基因)对小鼠肺腺癌的治疗作用。方法 将pcDNA3．1-GM-CSF基因和pcDNA3．0-IL-15基因2种细胞因子基因直接注射到小鼠肺腺癌瘤体内，采用病理分析和免疫组化方法，对pcDNA3．1-GM-CSF和pcDNA3．0-IL-15转基因治疗后的小鼠肿瘤组织进行分析。结果 应用pcDNA3．1-GM一CSF和pcDNA3．0-IL-15裸质粒DNA，通过直接注射均可抑制肿瘤生长。经pcDNA3．1-GM-CSF和pcDNA3．0-IL-15基因治疗后，肺癌组织内可见有部分坏死，瘤体内有大量炎性细胞及部分树突状细胞浸润。细胞因子GM-CSF和pcDNA3．0-IL-15基因在肿瘤组织中有不同程度的表达。结论 细胞因子裸质粒pcDNA3．1-GM-CSF和pcDNA3．0-IL-15直接注射，可以在组织中表达，并具有显著抗肿瘤作用。