重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响

目的 克隆人caspase-8催化结构域基因片段，并将其改建成2种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因，转染HeLa细胞，观察重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响。方法 用RT－PCR法，克隆人caspase-8催化结构域基因片段，经重组PCR改造，构建大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因。将其克隆入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pIRES2-EGFP，转染HeLa细胞，用荧光显微镜和倒置显微镜镜观察细胞的形态和结构。结果 用RT－PCR法，成功地克隆了人caspase-8催化结构域基因片段，构建了3种重构型人caspase-8基因及其真核表达载体。转染HeLa细胞后，重构型人caspase-8基因的表达可导致HeLa细胞死亡。结论 重构型人caspase-8基因在HeLa细胞中的表达可以有效地引起HeLa细胞死亡。     

重构型Caspase-6对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的 将人Caspase-6基因大小亚基顺序颠倒，表达为重构型Caspase-6分子，探讨其对细胞凋亡的促进作用。方法 RT－PCR获取人Caspase-6基因，测序判断正确后，通过重组PCR的方法构建大小亚基顺序颠倒的重构型Caspase-6（RevCasp6)基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白（GFP）蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP中，转染人宫颈癌细胞系HeLa，在荧光显微镜下观察细胞形态的变化，用电子显微镜进一步观察细胞的凋亡特征。结果 获得了人Caspase-6基因，并成功地构建了大小亚基顺序颠倒的Rev-Casp6基因。以构建的RevCasp6真核表达载体，转染HeLa细胞后，荧光显微镜观察到细胞生长不良，细胞核结构破坏和细胞死亡。电子显微镜观察显示，转染了RevCasp6基因的细胞呈凋亡的典型特征。结论 RevCasp6基因具有诱导HeLa细胞凋亡的作用。     

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建抗人HBsAg单链抗体基因，并分析其在COS—7细胞中的表达。方法：以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增其轻、重链可变区(VL、VH)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(C1y4Ser)3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L—VH—Linker—Vl结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pEGFP—N3，并转染COS—7细胞进行表达。结果：经测序表明，前导肽、连接肽、VL及Vh的序列正确。酶切鉴定证实，成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS—7细胞后，通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后，进行SDS—PAGE及westem blot分析，可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实，所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论：成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因，并可在COS—7细胞中分泌性表达。     

tBid基因的表达及其对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用

目的:观察tBid基因在骨肉瘤细胞中的表达及其对转染的SOSP-9607细胞的凋亡作用。方法:采用脂质体转染的方法,将tBid基因转染骨肉瘤细胞,间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达和细胞形态学变化,进一步电镜观察其超微结构改变。MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况,通过Annexin V、染色流式细胞仪检测来观察其促凋亡作用。结果:转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测tBid的表达,细胞出现凋亡。电镜观察呈现出典型的凋亡特征。MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制。Annexin V染色流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,与对照组细胞(凋亡率为6%)相比,其凋亡率为35.8%。结论:tBid基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。     

GFP共表达检测重组型Caspase-3对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的探讨由野生型人caspase-3大小亚基颠倒构建的重组型caspase-3的促细胞凋亡活性。方法用RT-PCR法获得人caspase-3基因。通过重组PCR进行改造,构建小亚基位于大亚基之前的两种重组型caspase-3基因,它们所对应的蛋白质的N端,分别带有或没有其自身识别的四肽序列。将上述基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pIRES2-EGFP中,转染人HeLa细胞,在荧光显微镜和电镜下观察转染细胞的形态和结构。结果成功地获得了野生型caspase-3基因及两种重组型caspase-3基因。构建了重组型caspase-3基因的表达载体。转染HeLa细胞后,重组型caspase-3基因在细胞中得到表达,随后引起细胞荧光强度下降,生长状况变差甚至死亡。电镜观察显示,许多细胞呈现凋亡的典型特征。结论重组型caspase-3可促进HeLa细胞的凋亡。     

GFP共表达检测重组型Caspase—3对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的 探讨由野生型人caspase-3大小基颠倒构建重组型capase-3的促细胞凋亡活性。方法 用TR－PCR法获得人caspase-3基因。通过重组PCR 进行改造,构建小亚基位于大亚基之前的两种重组型caspase-3基因,它们所对应的蛋白质的N端,分别带有或没有其自身识别的四肽序列。将上述基因克隆入绿色荧光蛋白（GFP)表达载体pIRES2-EGFP中,转染入HeLa细胞,在荧光显微镜和电镜下观察转染细胞的形态和结构。结果 成功地获得了野生型caspase-3基因及两种重组型caspase-3基因。构建了重组型caspase-3基因的表达载体。转染HeLa细胞后,重组型caspase-3基因在细胞中得到表达,随后引起细胞荧光强度下降,生长状况变差甚至死亡。电镜观察显示,许多细胞呈现凋亡的典型特征。结论 重组型caspase-3可促进HrLa细胞的凋亡。     

截短型人bid基因的克隆、表达和促凋亡作用的研究

目的 :探讨截短型bid(truncatedbid ,tbid)基因的表达对Hela细胞的促进凋亡活性。方法 :用RT PCR法克隆人全长bid基因 ,测序正确后 ,通过PCR截去编码N末端 6 0个氨基酸残基的基因 ,而获得tbid基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,用脂质体法转染Hela细胞。通过荧光显微镜、电子显微镜观察和TUNEL检测法 ,检测目的基因的表达对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果 :成功地构建了tbid基因的真核表达载体。以其转染Hela细胞后 ,tbid基因在细胞中得到表达 ,随后引起细胞荧光强度下降 ,生长状况不良甚至死亡。电镜观察及TUNEL检测的结果显示 ,许多细胞呈典型的凋亡特征。结论 :tbid基因的表达可促进Hela细胞的凋亡     

人TRBP基因在HEK-293细胞中的表达

目的：构建携带人TRBP（TAR RNA结合蛋白）基因的真核表达载体,并将其在HEK-293细胞中表达.方法：用RT-PCR的方法扩增获得TRBP全长cDNA,然后克隆入pFLAG-CMV4真核表达载体.脂质体法瞬时转染HEK-293细胞,间接免疫荧光和Western Blot检测目的蛋白表达.结果：成功获得了全长的TRBP cDNA,构建了含人的TRBP cDNA的真核表达载体.转染HEK-293细胞后提取蛋白,经电泳观察到在Mr46000存在与目的蛋白分子质量相符的条带,该条带可被抗TRBP多克隆抗体及抗FLAGmAb特异性识别.结论：TRBP哺乳动物表达系统的建立,为进一步研究TRBP的生物学效应奠定了基础.     

抗人精浆蛋白单克隆抗体Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单克隆抗体Fab段基因并在大肠杆菌中表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)克隆Fd段和k链基因；构建到噬粒pComb3中；并用ELISA、Westem blotting和免疫细胞化学分析证明表达的Fab段特异性结合人精浆蛋白。结果 从分泌抗人精浆蛋白的鼠单克隆抗体杂交瘤细胞系E4B7中克隆出了重链Fd段和k链基因，经序列测定表明，U属于鼠免疫球蛋白XⅢ家族，VH与鼠免疫球蛋白MUSIGHAEI同源性最高。将该Fd和k链基因克隆到表达载体pComb3中，在大肠杆菌中获得了表达。结论FLISA、Westem blotting和免疫细胞化学分析表明，表达的Fab段可以特异性的与人精浆蛋白结合。     

小鼠耳蜗神经营养因子-3基因的克隆及其基因工程细胞模型的建立

目的：克隆小鼠耳蜗组织神经营养因子－3（neurotrophin-3,NT3)基因，并转染该基因在体外培养的T淋巴细胞系的Jurkat细胞，建立能够表达和分泌NT3的基因工程细胞模型，为后续体内应用作准备。方法：用反转录PCR方法扩增NT3基因，定向克隆入测序载体pUC19。酶切和测序鉴定正确后，再以pUC19－NT3质粒为模板，通过PCR方法得到上下游能够与pCDNA3载体中酶切位点匹配的NT3片段，进一步克隆获得pCDNA3－NT3质粒。酶切鉴定正确的质粒经阳离子脂质体包埋转染入Jurkat细胞，通过G418反复筛选后，有克降隆形成再扩大培养；收集部分细胞提取其中的总RNA，反转录PCR检测有无NT3基因片段存在；并利用这些细胞的培养上清鉴定有无生物学活性。结果：正确克隆的小鼠耳蜗组织NT3基因转染Jurkat细胞后，能够表达和分泌NT3蛋白并具有生物学活性，促进离体毛细胞和听觉神经元的存活。结论：在体外建立表达NT3基因并分泌NT3蛋白的基因工程细胞模型是可行的，为进一步应用到体内治疗感音神经性聋奠定了实验基础。