免疫凋亡素e23sFv-Fdt-RC6对HER2阳性胶质瘤细胞U251的杀伤作用

目的:探讨靶向活性caspase-6融合蛋白对HER2阳性胶质瘤细胞系U251的促凋亡作用.方法:利用白喉毒素furin酶识别序列(Fdt)连接抗HER2单链抗体基因e23sFv和重构型caspase-6(RC6)基因,连接入pCMV载体,构建重组基因的真核表达载体pCMV-e23sFv-Fdt-RC6.脂质体转染HER2阳性胶质瘤U251细胞系,Western blot检测目的蛋白的表达.流式细胞术(FCM)检测转染后U251细胞的凋亡率,MTT法检测目的基因转染后对U251细胞增殖的影响.结果:双酶切及基因测序证实,pCMV-e23sFv-Fdt-RC6载体被成功构建.Western blot检测到转染表达载体48 h后的U251细胞中有活性caspase-6的表达.FCM检测到实验组细胞凋亡率比对照组显著增高.MTT实验观察到转染载体pCMV-e23sFv-Fdt-Rc6的U251细胞的增殖被明显抑制.结论:e23sFv-Fdt-RC6融合蛋白对HER2阳性胶质瘤细胞系U251有明显的促凋亡作用.     

人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中的表达

目的：观察人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中的表达及其对转染的Hep-2细胞的作用。方法：用RT-PCR方法获取人caspase-6全长cDNA，经重组PCR构建大小亚基次序颠倒的重构型caspase-6(re-caspase-6，简称rcasp6)。将所获重组基因克隆入真核表达载体pCMV，转染Hep-2细胞。用间接免疫荧光法及免疫细胞化学染色检测目的蛋白表达，HE染色和电镜观察转染细胞的形态和结构的变化，细胞计数检测转染目的基因后细胞生长状况的变化。结果：成功地获得了人重构型caspase-6基因(rcasp6)，并构建了真核表达载体，转染Hep-2细胞后，检测到目的蛋白的表达，倒置显微镜观察转染细胞有明显变化，培养情况下出现大量细胞固缩变小，伴随有细胞死亡。HE染色和电镜观察显示，固缩的细胞呈现凋亡的典型特征。结论：人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中表达，可使转染细胞的形态发生变化，出现大量的凋亡细胞。     

表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用

目的:构建针对人survivin基因的siRNA真核表达载体,检测其对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因表达的干涉作用.方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒稳定转染入SKBr-3细胞,RT-PCR、Western blot印记杂交和细胞免疫化学法检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果:经酶切鉴定及基因测序证实,重组质粒中已插入目的基因片段.RT-PCR显示两个干涉载体均抑制了目的基因的转录;Western blot印记杂交和细胞免疫化学检测结果显示pSUPER-S1对蛋白表达的抑制作用更强.结论:成功地构建了针对人survivin基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,并在人乳腺癌细胞株SKBR-3中有效发挥了对survivin基因的干涉作用.     

重组人肿瘤坏死因子-α诱导黏液表皮样癌细胞凋亡

目的: 探讨重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)作用于人黏液表皮样癌细胞(MEC-1)的效应与机制. 方法: 应用细胞记数、DNA降解片段琼脂糖凝胶电泳观察、电镜观察和细胞周期测定rhTNF-α作用后MEC-1细胞的凋亡状况. 结果: rhTNF-α作用于MEC-1细胞后,导致细胞存活数目减少,大量细胞发生凋亡;基因组DNA分解成寡聚核苷酸片段,DNA琼脂糖凝胶电泳有梯形条带;细胞周期发生改变,形态学观察细胞核皱缩,染色质边集. 结论: rhTNF-α是通过MEC-1细胞发生凋亡而发挥细胞毒作用.     

HER2基因表达与骨肉瘤预后

目的:研究骨肉瘤中HER2基因的表达与临床预后的关系。方法:对82例骨肉瘤患者的临床病理资料进行回顾性研究,应用HER2单克隆抗体对组织切片进行免疫组织化学染色,并将上述资料与患者的预后进行分析。结果:骨肉瘤患者HER2表达与患者预后相关(P<0.05),HER2高表达的骨肉瘤患者预后较差。结论:HER2检测是骨肉瘤预后判断的一项有价值的指标;同时,HER2为骨肉瘤的治疗提供一种可能的生物靶点。     

重组LacZ复制缺陷型腺病毒的构建和鉴定

目的:构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。方法:用AdEasy-1TM系统,在大肠杆菌中同源重组,构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-LacZ)。重组腺病毒在HEK293细胞内包装并扩增,测定病毒滴度、电镜鉴定病毒存在、斑点杂交检测其复制缺陷性,然后感染HeLa细胞X-gal染色检测LacZ的表达情况。结果:成功构建了重组LacZ腺病毒表达载体,包装获得的重组腺病毒的滴度为1.58×109PFU/m l。在转染的细胞和感染的靶细胞内均可检测到LacZ的表达。电镜下可见感染的HEK293细胞核内含晶格状结构的腺病毒包函体。斑点杂交提示重组病毒为复制缺陷型,其基因转移百分率和感染强度和感染时间有一定的相关性。结论:成功构建了表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。     

三种阳离子脂质体转染效率的测定

目的 测定研制的３种阳离子脂质体（Ａ,Ｂ,Ｃ）的转染效率,并且与ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ的转染效率进行比较。方法 采用分子克隆的方法。将ｌｕｅ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３载体。以质粒ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｃ与一定量的阳离子脂质体及ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染食管癌Ｅａ１０９细胞,一定时间后测定荧光强度以确定ｌｕｃ的表达量。结果 成功地构字质粒ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｅ,转染后,。发现阳离子脂质体Ａ的转染效率较高,接近ｌ     

人NT3、BDNF基因Tet-on可调控重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 NT3和pTRE Shuttle2 BDNF。用PI SceI和I CeuI双酶切后将所获NT3及BDNF基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno X连接 ,构建成pAdeno NT3及pAdeno BDNF的重组腺病毒载体。以电穿孔转化E .coli后挑取克隆进行PCR及酶切鉴定。结果 :重组腺病毒载体的PCR鉴定表明 ,在 312bp处出现特定的条带 ;酶切鉴定证实 ,得到约 2 3kb的预期片段 ,说明人NT3、BDNF基因与腺病毒载体pAdeno X已正确连接。结论 :成功地构建了含人NT3和BDNF基因的四环素可诱导重组腺病毒载体 ,为进一步实现其在雪旺细胞中可调控的高效表达奠定了基础     

HBsAg与恒定链融合基因真核表达载体的构建及鉴定

我国是乙型病毒性肝炎的高发国家 ,约有 1.2亿的HBV携带者 ,而原发性肝癌中 90 %的患者有HBV感染[1] 。研究者发现 ,72 .7%的肝癌癌旁组织及 4 5 %的肝癌组织中可检出HBsAg,故其可作为肝炎后肝癌患者免疫治疗的相对特异的“肿瘤相关分子”[2 ] 。如果能将HBsAg附加到来源于肝癌     

人重组型caspase-6融合蛋白对骨肉瘤E10细胞的靶向促凋亡作用

目的：探讨Her2靶向重组人caspase-6融合蛋白对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用。方法：将抗Her2单链抗体基因e23sFv与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和重构型caspase-6基因连接，构建成immunocaspase-6（e23sFv-PEⅡ-caspase-6）基因，将其克隆入质粒pCMV中，阳离子脂质体包裹法转染E10细胞：HE染色、电子显微镜观测转染后细胞形态学变化：免疫细胞化学染色检测目的基因表达：MTT法检测目的基因转染后细胞的生长状况。结果：目的基因转染后．HE染色、电子显微镜观察到细胞呈现典型的凋亡特征，免疫细胞化学染色检测出caspase-6的表达，MTT法检测发现细胞的增殖被明显抑制俨≤0．01）。结论：Her2靶向重组的人caspase-6融合蛋白能识别、结合Her2^＋骨肉瘤E10细胞．并促使其凋亡。