部分骨钙素启动子控制荧光素酶基因真核载体的构建及表达

目的 构建部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，转染细胞后检测报告基因对rhBMP-2的反应，以期用于rhBMP活性的定量测定。方法 用PCR方法扩增骨钙素部分启动子147bp，克隆入pGEM-3zf(-)中，经酶切鉴定和序列分析正确后，亚克隆人能稳定高效表达荧光素酶的真核表达载体pcDNA3-Luc中，构建真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，然后分别将pcDNA3-Luc和pcDNA3-OCP-Luc转染细胞，并检测其对rhBMP-2的反应。结果 成功构建了部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3-Luc大为降低，而且报告基因的表达与rhBMP-2剂量在一定范围内成线性正相关。结论 真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc的报告基因表达具有特异性，可代替直接测定骨钙素用于rhBMP-2活性的定量测定研究。     

重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的构建、表达及其活性鉴定

目的:构建重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6 基因的表达载体,转染SGC7901胃癌细胞后观察其促凋亡作用. 方法:采用重组PCR法,将抗HER2的单链抗体(e23sFv)通过白喉毒素的Furin识别位点的编码序列(FDT)与人重构型caspase-6(RC6)基因重组,构建融合蛋白表达基因e23sFv-FDT-RC6. 将所获得的重组基因克隆入真核表达载体pCMV,以脂质体法瞬时转染HER2阳性的SGC7901细胞和HER2阴性的HeLa细胞. MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况. 间接免疫荧光染色观察目的基因的表达对SGC7901细胞的促凋亡作用. 结果:把e23sFv-RC6,e23sFv-FDT-RC6基因克隆入真核表达载体pCMV,酶切鉴定和基因测序证明目的基因序列正确. 转染SGC7901和HeLa细胞后,Western Blot检测到目的蛋白的表达. MTT实验观察到转染pCMV-e23sFv-FDT-RC6的SGC7901细胞的增殖被明显抑制,间接免疫荧光染色可以观察到表达e23sFv-FDT-RC6融合蛋白的SGC7901细胞形态发生改变,部分细胞呈现典型凋亡特征. 结论:重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达可促进HER2阳性SGC7901胃癌细胞的凋亡.     

分泌性靶向促凋亡分子基因构建、表达及其对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用

为建立更敏感而特异的用于肿瘤基因治疗新策略,本研究将一段信号肽、抗肿瘤表面抗原HER2的抗体、具有膜转位作用的肽段和几种促凋亡分子融合,构建了几种靶向促凋亡蛋白。体内外实验研究证实,这种重组分子表达分泌后,能够特异性识别和内化进入HER2阳性肿瘤细胞,继而带有部分PEAII转膜结构域的促凋亡蛋白转位进入胞质,诱导细胞凋亡,实现特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞和抑制HER2阳性肿瘤生长的作用。     

含TK自杀基因真核表达载体的构建和鉴定

基因治疗恶性肿瘤是当前国内外研究的热点之一，其中以药物敏感基因治疗系统最引人注目。药物敏感基因(drug sensitive gene)又称为“自杀基因”(suicide gene)，可以编码某些病毒或细菌的酶类，从而催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体转变为具有毒性的代谢产物，干扰细胞DNA的合成，选择性地杀死快速增殖的肿瘤细胞，而对正常组织无毒、副作用。     

人fadd基因cDNA的克隆和诱导舌癌细胞凋亡的研究

目的：观察人fadd基因对舌癌（Tca-8113）细胞的凋亡诱导作用。方法：用反转录PCR获取人fadd基因，将基因克隆入真核表达载体pcDNA和pIRES2和pIRES2-EGFP中，脂质体法转染舌癌细胞，通过细胞计数、荧光显微镜及电镜观察、流式细胞仪等检测技术被转染细胞的生长及其凋亡状况。结果：成功获取了人fadd基因。与对照组相比，在转染1-3d内，fadd基因的表达导致舌癌细胞存活数目减少，大量细胞发生凋亡。结论：人fadd基因可以诱导转染的舌癌细胞发生凋亡。     

免疫凋亡素e23sFv-Fdt-RC6对HER2阳性胶质瘤细胞U251的杀伤作用

目的:探讨靶向活性caspase-6融合蛋白对HER2阳性胶质瘤细胞系U251的促凋亡作用.方法:利用白喉毒素furin酶识别序列(Fdt)连接抗HER2单链抗体基因e23sFv和重构型caspase-6(RC6)基因,连接入pCMV载体,构建重组基因的真核表达载体pCMV-e23sFv-Fdt-RC6.脂质体转染HER2阳性胶质瘤U251细胞系,Western blot检测目的蛋白的表达.流式细胞术(FCM)检测转染后U251细胞的凋亡率,MTT法检测目的基因转染后对U251细胞增殖的影响.结果:双酶切及基因测序证实,pCMV-e23sFv-Fdt-RC6载体被成功构建.Western blot检测到转染表达载体48 h后的U251细胞中有活性caspase-6的表达.FCM检测到实验组细胞凋亡率比对照组显著增高.MTT实验观察到转染载体pCMV-e23sFv-Fdt-Rc6的U251细胞的增殖被明显抑制.结论:e23sFv-Fdt-RC6融合蛋白对HER2阳性胶质瘤细胞系U251有明显的促凋亡作用.     

表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用

目的:构建针对人survivin基因的siRNA真核表达载体,检测其对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因表达的干涉作用.方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒稳定转染入SKBr-3细胞,RT-PCR、Western blot印记杂交和细胞免疫化学法检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果:经酶切鉴定及基因测序证实,重组质粒中已插入目的基因片段.RT-PCR显示两个干涉载体均抑制了目的基因的转录;Western blot印记杂交和细胞免疫化学检测结果显示pSUPER-S1对蛋白表达的抑制作用更强.结论:成功地构建了针对人survivin基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,并在人乳腺癌细胞株SKBR-3中有效发挥了对survivin基因的干涉作用.     

转位肽/粒酶B融合蛋白基因的构建、表达及对细胞生长的抑制作用

目的：研究转位肽／粒酶B融合蛋白对细胞生长的抑制作用。方法：采用重组PCR法，将绿脓杆菌外毒素(PE)部分转位肽编码序列与活性型粒酶B(GrBa)基因相融合，构建PE Ⅱ-GrBa融合蛋白基因，以粒酶活性中心丝氨酸突变的PE Ⅱ—mGrBa作为阴性对照。将所获重组基因克隆入真核表达载体pcDNA3和pIRES2-EGFP中，以脂质体法瞬时转染Hela等细胞系，通过与GFP共表达，用MTT比色、TUNEL及间接免疫荧光染色，检测PE Ⅱ—GrBa基因的表达对转染细胞的形态和生长的影响。结果：表达PE Ⅱ—GrBa融合蛋白的细胞的细胞骨架发生异常，细胞生长受到抑制，部分细胞呈现凋亡特征。结论：PE Ⅱ—GrBa融合蛋白的表达可抑制细胞生长。     

人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中的表达

目的：观察人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中的表达及其对转染的Hep-2细胞的作用。方法：用RT-PCR方法获取人caspase-6全长cDNA，经重组PCR构建大小亚基次序颠倒的重构型caspase-6(re-caspase-6，简称rcasp6)。将所获重组基因克隆入真核表达载体pCMV，转染Hep-2细胞。用间接免疫荧光法及免疫细胞化学染色检测目的蛋白表达，HE染色和电镜观察转染细胞的形态和结构的变化，细胞计数检测转染目的基因后细胞生长状况的变化。结果：成功地获得了人重构型caspase-6基因(rcasp6)，并构建了真核表达载体，转染Hep-2细胞后，检测到目的蛋白的表达，倒置显微镜观察转染细胞有明显变化，培养情况下出现大量细胞固缩变小，伴随有细胞死亡。HE染色和电镜观察显示，固缩的细胞呈现凋亡的典型特征。结论：人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中表达，可使转染细胞的形态发生变化，出现大量的凋亡细胞。