视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的：从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子（ROP）并建立ROP－绿色荧光蛋白（GFP）融合基因转基因小鼠模型。方法：用PCR法从基因组内扩增ROP，通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体，并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pMOP-EGFP表达质粒经Not I酶切线性化后，用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核，制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建小鼠，基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传化后，取眼球进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察视网膜下GFP的表达。结果：从基因组内扩增出了2.1kb的小鼠ROP，成功构建了小鼠ROP－GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建，分别命名为C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU21,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论：成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠，它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制，还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。     

单一术者机器人辅助腹腔镜前列腺癌根治术术中指标影响因素分析

目的 探究行机器人辅助腹腔镜前列腺癌根治术（RALP）手术时间、术中出血量以及神经保留的影响因素。方法 收集2016年1月1日至2017年10月1日184例于海军军医大学（第二军医大学）长海医院泌尿外科由单一术者完成RALP的局部或局部进展性前列腺癌患者的手术资料及临床信息,分析患者年龄、前列腺体积、术后病理Gleason评分、盆腔淋巴结切除范围、穿刺方式等对手术时间、术中出血量和神经保留的影响。对手术时间和术中出血量的影响因素进行多因素线性回归分析,手术时间与前列腺体积的相关性采用线性相关分析,不同盆腔淋巴结切除范围的患者RALP手术时间的比较采用LSD-t检验。对RALP术中神经保留影响因素的分析采用多因素logistic回归分析。RALP术中未保留、保留单侧与保留双侧神经患者年龄的差异采用单因素方差分析,术后病理Gleason评分、盆腔淋巴结切除范围和穿刺方式的差异采用Kruskal-Wallis H检验。结果 多因素线性回归分析结果显示前列腺体积和盆腔淋巴结切除范围是RALP手术时间的独立影响因素（P均<0.01）;前列腺体积与手术时间呈正相关（r=0.201,P=0.006）;盆腔淋巴结扩大切除患者的RALP手术时间长于闭孔切除者,且盆腔淋巴结闭孔切除者的手术时间长于未切除者（P均<0.01）;患者年龄、前列腺体积、术后病理Gleason评分、盆腔淋巴结切除范围、穿刺方式等对RALP术中出血量无明显影响（P>0.05）。多因素logistic回归分析结果显示,年龄、术后病理Gleason评分、盆腔淋巴结切除范围和穿刺方式是RALP术中神经保留的独立影响因素（OR=0.949,95% CI：0.906~0.995,P=0.027;OR=0.742,95% CI：0.551~0.999,P=0.049;OR=0.540,95% CI：0.322~0.903,P=0.019;OR=0.457,95% CI：0.230~0.905,P=0.025）。RALP术中未保留、保留单侧和保留双侧神经的前列腺癌患者分别为108、20、56例,3组患者的年龄、术后病理Gleason评分、盆腔淋巴结切除范围和穿刺方式的差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 前列腺体积大以及进行盆腔淋巴结切除的前列腺癌患者手术时间较长,年龄大、术后病理Gleason评分高、进行盆腔淋巴结切除以及经直肠穿刺不利于RALP术中神经保留。     

环状RNA在肿瘤中作用的研究进展

环状RNA（circRNAs）是一种通过反向剪接机制由线性RNA前体的5'端和3'端共价相接形成具有特殊环状结构的非编码RNA（ncRNAs），与基因的转录及转录后表达调控有关，可能以不同于其亲代转录本的新方式呈现遗传信息。近年，随着分子生物学、生物信息学以及高通量检测技术的不断发展，circRNAs逐渐被发现不仅存在于细菌、真菌、植物中，也大量存在于哺乳动物中。从作用于miRNAs和RNA结合蛋白，到充当转录调节因子，它们在基因调控和正常细胞稳态中的重要作用开始被认识。作为ncRNAs的新成员，circRNAs在多种疾病和肿瘤中的重要作用逐渐被发现。在此综述中，我们介绍了circRNAs的形成机制和功能，并总结了circRNAs在肿瘤发生和发展中的生物学作用。     

乙型肝炎病毒preS2蛋白在转基因小鼠肝脏中的表达

目的：分析乙型肝炎病毒preS2蛋白在3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠肝脏中的分布及其病理学作用。方法：采用原核显微注射法将质粒pcDNA3.1-preS/S^t注射入小鼠受精卵雄原核，制备转基因小鼠。PCR法在基因组小平筛选3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠首建者（founder）及后代；免疫组织化学法在蛋白水平检测preS2蛋白在这些小鼠中的表达；H－E染色分析转基因小鼠肝组织的病理学变化。结果：以原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，共出生15只新生小鼠，其中存活7只，经PCR检测后获得2只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(preS/S^t）SMMU。免疫组织化学检测发现转基因小鼠肝细胞质中有preS2蛋白表达，H－E染色发现转基因小鼠肝组织中央静脉周围有淋巴细胞聚集。将这2只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F2代。结论：本研究成功建立了稳定遗传3’末端缺失的preS/S基因并表达preS2蛋白的转基因小鼠C57－TgN(preS/S^t)SMMU，它将是体内研究3’末端缺失的preS/S基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间关系的理想动物模型。     

肥胖基因及其产物

肥胖基因及其产物Ｌｅｐｔｉｎ在肥胖的发生中起重要作用，人们已定位克隆了ｏｂ基因并对ｏｂ基因及其调控序列，ｏｂ基因的产物及其功能，各种因素对ｏｂ基因及其产物表达的影响等方面作了深入研究，并提出了机体调节体重的可能途径。本就以上几个方面作一综述。     

乙型肝炎病毒(adr亚型)preS2-S基因转基因小鼠的建立

目的：建立可表达乙型肝炎病毒（adr亚型）包膜中蛋白的转基因小鼠品质。方法：通过原核显微注射法制备带有乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因的转基因小鼠。应用PCR方法筛选乙型肝炎病毒preS2-S基因转基因首建者（founder）小鼠，再以免疫组织化学法分析乙型肝炎病毒蛋白在这些小鼠中的表达特性，PCR和免疫组化均阳性的转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配用于传代培育，并用PCR法检测其子代小鼠。结果：共注射受精卵69枚。选取存活受精卵58枚分别植入4只假孕小鼠，产仔并存活23只。经尾组织DNA PCR筛选得到5只整合preS2-S基因的founder小鼠，免疫组织化学法发现其中3只小鼠的肝脏中表达HBsAg，进而对其中表达较强的阳性鼠进行保种。结论：所建立的乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因转基因小鼠品系具有表达乙肝病毒中蛋白的生物学特性，这一品系的建立为中蛋的相关研究提供了技术平台。     

联合外周血循环肿瘤细胞评估索拉非尼治疗肝细胞癌疗效

目的 通过联合外周血循环肿瘤细胞（CTC）评估索拉非尼治疗肝细胞癌的疗效,提高对肝癌CTC临床应用的认识。方法 本科室基于BIOMARKERBOX平台,利用独特差减富集技术—肿瘤标示物免疫荧光染色—肿瘤细胞染色体荧光原位杂交整合技术平台（SET-iFISH）分离2例肝癌患者外周血,后将肿瘤标示物免疫荧光染色与染色体荧光原位杂交整合为同步进行的检测技术鉴别出CTC,并结合2例患者的临床表现及生存情况进行分析。结果 肝癌CTC经SET-iFISH标记为CK-/DAPI+/FISH（CEP8单体）+/CD45-。本科室采用连续3天分离患者外周血（7.5 ml）,病例1外周血中检测到CTC 2个,病例2外周血中未见CTC,病例2目前已无瘤生存13个月。结论 联合外周血CTC评估索拉非尼治疗肝细胞癌的疗效可能成为一种有效、无创的液体评估手段,为肝癌临床诊治提供新的思路。     

位点特异性重组系统及其应用

位点特异性重组系统可在重组酶参与下介导特异性位点间的DNA发生切除，整合或易位，该系统可克服传统基因工程技术的一些局限性，对基因进行定时、定位的改造，并可进行大片段的染色体改造工程。应用较多的Cre/loxP,FLP/FRT和R／RS系统，本主要介绍了这三个系统的结构特点并以Cre/loxP系统为例介绍其在转基因小鼠、基因剔除小鼠，基因替换小鼠和染色体工程中的应用，最后提出了全面应用该系统有待解决的一些问题。     

干细胞样肝原始细胞的体外分化

目的：探讨干细胞样肝原始细胞集落体外分化的潜能。方法：分离孕13.5d的C57BL／6小鼠胎肝组织细胞并培养，第2天出现圆形成椭圆形干细胞肝原始细胞集落，随机挑取边界清楚的细胞集落分别培养，利用倒置相差显镜连续观察细胞生长过程中的形态学变化并用显微摄影记录结果，最后利用免疫细胞化学分析鉴定分化后细胞的性质。结果：干细胞样肝原始细胞集落在体外培养时可形成类似肝小叶的形状，集落中央大部分细胞分化成双核细胞，集落周边细胞仍为单核细胞，但体积明显增大，整个集中的细胞呈放射状排布。分化后，细胞群中的部分细胞表达成熟肝细胞标志白蛋白（albumin)，少部分细胞表达胆管上皮细胞标志细胞角蛋白19（cytokeratin19,CK19)，但所有细胞均不表达低分化肝细胞标志α－甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP)。结论：干细胞样肝原始细胞在体外具有我向分化能力，可分化为表达成熟肝细胞的胆管上皮细胞标志的细胞。     

HBV preS2-S DNA免疫诱导小鼠体液免疫应答

目的:构建HBV表面抗原preS2-S基因表达质粒,并探讨其在小鼠体内的表达及诱导体液免疫应答的能力.方法:采用PCR方法,以PBR322-HBV2.0(adr亚型)质粒DNA为模板获得HBV preS2-S基因,并将其重组进入pcDNA3.0表达载体中,转染7721细胞系进行稳定表达;以此重组质粒免疫小鼠,ELISA方法检测免疫小鼠抗HBs抗体浓度.结果:构建了HBV preS2-S基因的表达质粒pcDNAS2-S,该表达质粒可在7721细胞中稳定高效表达;免疫接种小鼠2周后抗HBs抗体浓度明显升高,接种后第4周布比卡因处理组小鼠抗HBs抗体的浓度达到峰值161.4 mIU/ml,布比卡因非处理组第5周抗HBs抗体的浓度可达133.7 mIU/ml.结论:所构建的pcDNAS2-S表达质粒能有效表达并诱导小鼠体液免疫应答.