PTEN基因在人和树鼠句肝细胞癌组织中低表达

目的：研究人和树鼩肝癌和癌旁组织中PTEN基因的表达情况以及与肝癌侵袭转移的关系。方法：用RT-PCR和免疫组织化学方法分别检测人肝癌、癌旁组织和正常组织以及树鼩肝癌和癌旁组织中PTEN mRNA和PTEN蛋白的表达情况。结果：PTEN mRNA在人的正常组织、癌旁组织、肝癌组织中的表达依次降低,差异有统计学意义,t值分别为-0.955和-10.065,P值均〈0.001;树鼩肝癌组织中PTEN mRNA的表达显著低于癌旁组织中的表达,t=-3.25,P=0.004。PTEN蛋白的表达在人的癌旁组织显著高于肝癌组织,t=-2.163,P=0.038;在树鼩则无差别,t=0.757,P=0.459。结论：PTEN基因的表达缺失可能与肝癌的发生有关;用树鼩进行肝癌发病学的研究基本上是可行的。     

人乙型肝炎病毒在树鼩中传代感染的研究

用人乙型肝炎病毒(HHBV·)感染树鼩(Tree shrews)后,取其HBsAg及(或)HBeAg阳性的树齣血清传代感染另一批树鼩;18只树鼩分四批感染至第四代,经检测发现17只树鼩血清或肝细胞中HBV标志物阳性(94.4%);血清转氨酶(SGPT)升高,肝组织有不同程度的炎症变化。此结果表明HHBV能够在树鼩间连续传代复制,为人乙型肝炎病毒感染树鼩动物模型的建立提供又一佐证。     

RNAi沉默MCM7基因对人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠移植瘤影响研究

目的探讨微小染色体维持蛋白7(miniehromosome maintenanceprotein7,MCM7)基因RNAi(RNA interference)的重组慢病毒载体,对人肝癌细胞SMMC-7721 MCM7基因表达和裸鼠移植瘤生长的影响。方法构建重组逆转录慢病毒载体MCM7-shRNA,以MCM7基因沉默重组慢病毒颗粒(LV-shRNA-MCM7)感染SMMC-7721细胞,作为实验组;以对照慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC)感染SMMC-7721细胞,作为阴性对照组;空白对照组常规培养,不做任何处理。通过嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株。3组细胞分别接种至裸鼠皮下,建立人肝癌裸鼠移植瘤模型。观察裸鼠成瘤情况、移植瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线;4周后测定肿瘤体积和质量,并用RT-PCR、实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法及免疫组织化学法检测移植瘤中MCM7的表达情况。结果 MCM7-shRNA慢病毒载体构建成功。裸鼠接种癌细胞后第6天均有肿瘤形成,与空白对照组和阴性对照组相比,实验组的肿瘤生长速度明显减慢,实验组、阴性对照组和空白对照组的瘤体平均体积分别为(27.72±7.80)、(81.86±10.91)和(79.75±16.61)mm3,差异有统计学意义,F=61.949,P<0.05;实验组、阴性对照组和空白对照组的瘤体平均质量分别为(0.19±0.06)、(0.501±0.14)和(0.509±0.18)g,差异有统计学意义,F=18.41,P<0.05。实验组MCM7mRNA的相对表达量为0.253±0.198,阴性对照组1.213±0.548,空白对照组1.201±0.744,实验组相比阴性对照组和空白对照组明显下降,差异有统计学意义,F=4.091,P<0.05;实验组MCM7蛋白相对表达量为0.207±0.015,阴性对照组1.116±0.062,空白对照组1.088±0.040,实验组相比阴性对照组和空白对照组明显下降,差异有统计学意义,F=292.778,P<0.05。MCM7蛋白在阴性对照组和空白对照组中阳性表达率均为100%(10/10),在实验组中为30%(3/10),实验组明显低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义,χ2=18.261,P<0.001。结论慢病毒沉默SMMC-7721细胞MCM7基因表达能有效抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,MCM7基因可能成为肝癌基因治疗的有效靶点。     

EXPERIMENTAL PRIMARY LIVER CANCER IN TREE SHREWS EXPOSED TO HUMAN HEPATITIS B VIRUS AND AFLATOXIN B_(1)

On the basis of the successful establishment of an animal model in tree shrews experimentally in fected with human hepatitis B virus (HHBV), a study on the hepatocarcinogenic effects of HHBV and aflatoxin B1 (AFB1) by using this animal model was conducted through a lifelong experiment. Among 41 tree shrews exposed to AFB1, 17 were experimentally infected by HHBV and 24 were uninfected. After 158 weeks, significant difference of primary liver cancer (PLC) incidence was present between the HHBV infected (52.94%) and uninfected (12.5%) groups (p<0.05). No difference was found between these two groups in the amount of AFB4 ingestion. Moreover, 1/9 of the tree shrews infected only by HHBV but not exposed to AFB4 developed PLC. No PLC was found in 6 tree shrews that had neither been infected with HHBV nor been exposed to AFB4. These results suggest the possible etiologic relationship between HHBV infection and PLC, as well as the synergetic effects of HHBV and AFB4 during PLC development.     

树鼩实验性肝癌过程中GGT酶阳性肝细胞灶、IGF-Ⅱ及HBxAg异常表达

动态观察ＨＢＶ与ＡＦＢ１诱发树肝细胞癌（ＨＣＣ）病变过程中肝癌前病变γ－谷氨酰转肽酶阳性肝细胞灶（ＧＧＴ阳性灶）、胰岛素样生长因子Ⅱ（ⅠＧＦ－Ⅱ）发生情况，探讨ＨＣＣ发生的可能机制。实验动物分４组，Ａ组：ＨＢＶ阳性和摄入ＡＦＢ１；Ｂ组：ＨＢＶ阳性组；Ｃ组：摄入ＡＦＢ１；Ｄ组：空白对照。组织化学及免疫组织化学检测肝活检组织。结果：（１）肝癌前病变ＧＧＴ阳性灶在各实验组不仅灶数量，而且灶大小均明显高于空白组（Ｐ＜０．０５），且双诱癌因素组（Ａ）灶数量明显大于单诱癌因素组（Ｂ、Ｃ）（Ｐ＜０．０５）；（２）实验第１５周，即有ＩＧＦ－Ⅱ阳性表达，在第４５周阳性率明显高于第７５周（Ｐ＜０．０５）；（３）ＨＢＶ感染组（Ａ，Ｂ）动物肝组织中ＨＢｓＡｇ阳性率高达９２．１％，首次在树肝组织中检出ＨＢｘＡｇ，且阳性率达８６．５％。提示：ＨＢＶ与ＡＦＢ１协同致树ＨＣＣ；ＨＣＣ发生早期就有ⅠＧＦ－Ⅱ异常表达。     

树Qu肝活检及麻醉和抽血技术

为定期观测树Ｑｕ肝脏及血液指标的变化，建立了可对树Ｑｕ反复进行肝活检和抽血的技术，并对术中所用的两种麻醉方法作了比较。作者用不同麻醉方法对１５６只树Ｑｕ进行了９１３例（次）肝活检技术，其中７０只树Ｑｕ每只反复肝活检７￣１０次。手术间隔期为２周至２个月不等。氯胺酮麻醉时无死亡，也未发现严重的术后并发症。抽血１０００多例（次），其中４０只树Ｑｕ被反复抽血２０次，间隔期从２周至３个月不等，无事故发生。     

用原位杂交对树鼩肝组织乙型肝炎病毒DNA定位及其与黄曲霉毒素B_1在肝癌发生中的作用

用生物素标记的HBV DNA探针对经83～158周实验的55只树鼩肝组织的福尔马林固定、石蜡包埋的切片进行原位分子杂交研究。在45只接种过人HBV的树鼩中,有30只在肝细胞检出HBV DNA。这55只树鼩,有41只摄入了AFB_1,其中肝细胞HBV DNA阳性的A组22只,有10只发生了HCC;19只HBVDNA阴性的B组,只发生2例HCC,两组差别显著(P<0.05)。未接触过AFB_1的14只树鼩中,肝细胞HBVDNA阳性的8只(C组),发生1例HCC;而HBV DNA阴性的6只(D组)无HCC发生。提示HBV和AFB_1在诱发树鼩HCC中起协同作用;并支持HBV感染与HCC存在病因学关系的观点。该实验HBV DNA阳性物质主要分布于癌外肝细胞胞浆内,少数位于肝细胞核。癌组织内HBV DNA阳性率低于癌外肝组织。与在人肝癌研究的结果一致。表明树鼩是研究HBV致癌分子机理的较好的模型。     

乙型肝炎动物模型的研究

目的 建立树Qu和熊猴的乙肝动物模型。方法 用含HBV的人血清接种给7批30只熊猴、6批233只树Qu，每周定期采血、定期肝组织活检。用改良赖氏法、ELISA、PCR、原位杂交、免疫组化分别检测血清ALT、HBV标志物、HBV－DNA及肝组织中HBsAg和HBV－DNA。结果 树Qu接种人HBV（HHBV）后，90％呈急性感染，56％为可持续1年以上的慢性感染，33％持续2年2月，肝细胞内HBsAg阳性率达80％，熊猴接种HHBV后，血清HBV标志物呈一过性，个别猴肝细胞内HBsAg呈弱阳性。结论 熊猴对HHBV并不敏感，而树Qu对HHBV感染有较高的敏感性，有望成为HHBV的动物模型。