B16M高低转移株的筛选及其生物学异质性的分析

目的 筛选B16M高低转移株,以探讨B16M的转移异质性及机制.方法 通过B16M自发肺转移模型筛选出转移性能不同的细胞株,并用实验性和自发性肿瘤转移模型验证其在体内生长、转移性. 通过细胞增殖、3H-TdR参入实验、流式细胞技术、细胞侵袭离散实验研究了高、低转移B16M细胞株体外增殖能力、侵袭能力以及对离散因子的反应的差异,Western印迹实验研究细胞c-met表达及活化水平. 结果在所筛选出的3株可疑高转移B16M细胞株中,H3 B16M细胞接种于同系C57BL/6小鼠体内所形成的原发瘤重量、实验和自发性肺转移结节数明显高于其他细胞株;该细胞株增殖能力、侵袭性及对离散因子的反应能力的也明显高于其他细胞株.c-met表达及磷酸化水平也升高.结论成功的筛选出B16M 高、低转移细胞株,两者在细胞增殖、侵袭能力、离散能力等方面有差别.这种差异可能与c-met有关.     

SHP-2酪氨酸磷酸酶激活突变促进白细胞黏附和迁移的观察

目的 采用已经建立的SHP-2 D61G基因敲入小鼠为研究对象,观察SHP-2激活突变是否对白细胞的黏附、侵袭及细胞因子分泌产生影响,并探讨可能的分子机制.方法 常规分离小鼠白细胞,Fibronectin黏附实验检测细胞黏附能力并用结晶紫染色定量,Transwell小室分析细胞迁移,半定量RT-PCR分析白细胞介素-2(IL-2)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达,ELISA法检测细胞培养上清中IL-2及TNF-α浓度,凝胶阻滞实验分析白细胞内NF-κB核内转移情况.结果 SHP-2 D61G/+激活突变的小鼠白细胞黏附、迁移能力较对照小鼠的白细胞明显增强;突变小鼠白细胞IL-2及TNF-α mRNA表达丰度明显增高,其培养上清中IL-2、TNF-α浓度也相应升高;突变小鼠白细胞NF-κB核内转移明显增多.结论 SHP-2激活突变后可能通过增强的NF-κB信号途径,促进白细胞黏附并侵袭;同时增强其分泌炎症因子的能力,可能介导多器官损伤.     

Gab2 在SHP-2酪氨酸磷酸酶激活突变所致小鼠髓系异常增殖中的作用

 目的：观察SHP-2信号通路中关键接头蛋白Gab2对SHP-2激活突变引发的小鼠髓系异常增殖是否具有调控作用。方法：用Gab2-/-和SHP-2D61G/+模型小鼠建立4种基因型(SHP-2+/+、Gab2-/-、SHP-2D61G/+和SHP-2D61G/+/Gab2-/-)小鼠,解剖分析其脾大小,外周血白细胞计数,流式细胞术检测外周血及骨髓髓系细胞表面标志分子Mac-1和Gr-1并计数Mac-1和Gr-1阳性髓系细胞比例,骨髓造血干/祖细胞集落形成实验检测小鼠造血干细胞或祖细胞对细胞因子反应性,Western blotting和免疫沉淀实验检测骨髓来源肥大细胞经IL-3刺激后磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)和磷酸化胞外信号调节激酶(p-ERK)的活化水平,以及Gab2与SHP-2蛋白的结合情况。结果：敲除Gab2后显著减轻SHP-2激活突变导致的小鼠髓系增殖表型,主要表现在：脾指数减小,外周血白细胞减少,小鼠髓系来源的Mac-1和Gr-1阳性细胞比例降低。与SHP-2D61G/+小鼠相比,经IL-3刺激后,骨髓细胞的集落形成能力显著降低;骨髓来源肥大细胞内p-ERK和p-Akt表达明显下调,SHP-2D61G/+/Gab2-/-小鼠肥大细胞内无Gab2与SHP-2结合。结论：敲除Gab2可以明显减轻SHP-2D61G/+激活突变导致的小鼠髓系异常增殖,这种减轻作用可能与SHP-2无法与Gab2结合而导致下游信号途径ERK和Akt活化减弱有关。     

PCR技术应用进展

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术自从1985年问世以来,就以其简便、快速、灵敏、特异等特点受到了分子生物学家们的普遍重视,目前该技术已应用于传染病、遗传病诊断、肿瘤癌基因的研究及基因工程的分子克隆等诸多方面。近两年,国内利用PCR技术的分子生物学研     

SHP-2酪氨酸磷酸酶在DNA损伤性放化疗引发的小鼠骨髓毒中的作用

目的研究酪氨酸磷酸酶SHP-2在放、化疗引发的骨髓毒的调节作用,初步探讨其可能的分子机制。方法分别从野生型(Wild-type,WT)、SHP-2杂合突变型(SHP-2 /-)及SHP-2纯合突变型(SHP-2-/-)胚胎鼠(9.0~9.5d)的卵黄囊中获取造血祖细胞,用细胞因子IL-3(Interleukin-3,0.5ng/ml)、SCF(stem cell factor,0.5ng/ml)将造血祖细胞定向诱导分化为粒-巨噬造血细胞系(granulocyte-macrophage,GM)。60Coγ射线及化疗药物顺铂(Cisplatin,CDDP)处理后,台盼蓝染色法观察比较三种GM细胞增殖抑制率的差异;集落形成实验(Colony-forming Units,CFU)分析比较卵黄囊造血祖细胞集落形成能力的差异;血细胞计数法检测比较WT小鼠和SHP-2 /-小鼠在照射或化疗后外周血中白细胞、红细胞及血红蛋白水平的变化;Western Blot检测Erk在WT及SHP-2-/-造血细胞中的表达与磷酸化水平。结果在CDDP或60Coγ射线导致的细胞损伤反应中,SHP-2-/-造血细胞的生存能力较SHP-2 /-和WT造血细胞增强;相比WT小鼠,SHP-2 /-组小鼠的白细胞、血红蛋白及红细胞数量降低程度减轻;SHP-2-/-造血祖细胞克隆集落形成能力较SHP-2 /-组及WT组增强;提示SHP-2-/-突变可以减轻CDDP或60Coγ导致的骨髓毒性。Western Blot显示在CDDP损伤反应中,SHP-2-/-抑制Erk的磷酸化。结论SHP-2参与调控放、化疗导致的骨髓毒性,其分子机制可能与SHP-2对Erk活化调节相关。     

环境污染物As及SHP2D61G/＋激活对小鼠成纤维母细胞miRNA表达谱的影响

目的 建立环境致癌物与基因突变联合因素影响下的miRNA表达谱,为肿瘤发生机制的进一步研究提供新线索.方法 同等条件下,首先制备SHP2＋/＋野生型（wild type,Wt）及SHP2D61G/＋激活突变（gain-of-function mutation,GOF mutation）小鼠永生化的成纤维母细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEFs）细胞,之后以0.5 μmol/L的三氧化二砷急性处理MEFs细胞48 h后提取细胞总RNA,用小鼠miRNA芯片杂交/分析,建立miRNA（microRNA,miRNA,miR）表达谱,筛选差异表达显著者,用RT-PCR进行验证.结果 重金属化合物三氧化二砷处理SHP2＋/＋野生型和SHP2D61G/＋突变的MEFs细胞48h后,数十个miRNAs出现差异性表达,miRNA在三氧化二砷诱导前后的细胞或SHP2激活突变与否的细胞出现表达增加或减少,且发现受三氧化二砷和SHP2激活突变影响变化一致的miRNAs,如mmu-miR-100（表达下降）、mmu-miR-1907（表达升高）等,RT-PCR检测发现mmu-miRNA-100、mmu-miRNA-1907的表达趋势与芯片结果是一致的.结论 基因突变与环境污染可以影响MEFs细胞的miRNA表达谱出现明显改变,这些改变可能是细胞恶性转化及肿瘤发生的基础.     

细胞凋亡抑制基因Bcl－2对NIH3T3细胞增殖及辐射敏感性的影响

以含Ｂｃｌ－２的重组逆转录病毒转染包装细胞系ＰＡ３１７，经Ｇ４１８抗性筛选，获得单克隆细胞，扩增并收集培养上清感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，进而完成Ｂｃｌ－２基因向ＮＩＨ３Ｔ３细胞的导入。后者软琼脂集落形成率与细胞增殖速率均高于对照组，而辐射敏感性低于对照组。表明Ｂｃｌ－２基因对ＮＩＨ３Ｔ３细胞的增殖和辐射敏感性均具有一定的影响。     

SHP-2酪氨酸磷酸酶激活突变促进组织白细胞浸润和器官损伤

目的观察SHP-2D61G/+酪氨酸磷酸酶激活突变对组织白细胞浸润、细胞因子分泌及多器官损伤的影响。方法分别以SHP-2D61G/+激活突变敲入的模型小鼠和野生型C57BL/6小鼠为研究对象,ELISA法检测小鼠血清和白细胞培养上清液中IL-2及TNF-α浓度;采用常规组织切片和HE染色观察心、肺、脾等组织病理学改变;放射免疫法检测血清中丙氨酸转氨酶和心肌肌钙蛋白I的水平。结果 SHP-2D61G/+激活突变小鼠脾、肺组织中白细胞浸润较野生型对照小鼠明显增加,心肌肥大,出现明显炎症损伤型组织学变化;与野生型对照相比,突变小鼠血清及白细胞培养上清液中IL-2和TNF-α浓度均显著增加(P<0.01),血清丙氨酸转氨酶及心肌肌钙蛋白I水平亦显著增高(P<0.01)。结论 SHP-2D61G/+激活突变增强白细胞分泌炎症因子的能力,促进组织白细胞严重浸润和脾、肺、心等多器官损伤,进而导致多器官功能障碍。