弓形虫SAG1-MIC3融合基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建编码弓形虫RH株膜表面蛋白1（SAG1）和微线体蛋白3（MIC3）的重组真核表达载体pcDNA3．1-SAG1-MIC3并鉴定，为弓形虫疫苗研制作准备。方法采用PCR技术从弓形虫基因组DNA中分别扩增SAGl和MIC3基因片段。分别克隆人pMD18T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定；采用亚克隆技术将SAG1和MIC3基因克隆至真核表达载体pcDNA3．1（-），经含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性重组质粒pcDNA3．1-SAG1-MIC3，PCR、酶切和测序鉴定；采用脂质体法将重组载体转染Hela细胞，经RT—PCR法检测转染细胞转录情况。结果MIC3和SAG1基因的TA-cloning经PCR和酶切鉴定，大小分别为933bp和789bp，与预期值一致；pcNDA3．1-SAG1-MIC3经酶切鉴定，目的片段约为1722bp．与SAG1MIC3长度相当；测定重组载体的核苷酸序列。与GenBank中的相应序列100％同源；PCR验证载体携带的SAG1-MIC3融合基因在Hela细胞中转录生成mRNA。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．1SAG1-MIC3．为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用

目的 建立登革1～4型病毒的多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)快速检测及分型方法。方法 参照登革1～4型病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物，并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性，随后对PCR反应条件进行优化，以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照，验证其特异性。并对2003年30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测，阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性。结果 采用多重PCR引物对登革1～4型病毒进行扩增，分别获得295、237、118、347bp片段，与设计相符；而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果，30份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83．3％(25／30)，其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及中国1997、1999年流行株GD14／97、G1305／99同源性分别为97％、97％、98％。结论 实验证明，所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革1～4型病毒，为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法。     

海南省1998年虫媒病毒血清流行病学调查

应用间接免疫荧光法对海南省驻地部队和三个地区人群共６０７份人血清检测１２种虫媒病毒抗体。驻地部队（３８５份）和当地人群（２２２份）,黄病毒抗体阳性率分别为５．７％和１０．４％,甲病毒抗体阳性率分别为０．５２％和４．９％。由此可见,海南省驻地部队及当地人群存在虫媒病毒感染。在该岛的人群中,不同地区的甲病毒抗体阳性率分布不同。从病毒种类来看,以罗斯河病毒抗体阳性率最高,其抗体效价终作者单位：５１０５０７广州军事医学研究所点达１∶８０,提示海南地区可能存在罗斯河病毒自然疫源地。驻地部队黄病毒和甲病毒抗…     

广东省部分地区登革热监测分析

目的：加强广东省登革热的监测,防止该病的大流行。方法：收集发烧可疑患者的血标本及蚊子标本作病原分离,并进一步用ＲＴ－ＰＣＲ鉴定;采集监测点健康人血标本,应用间接免疫荧光试验作抗体水平调查。结果：在佛山、沙湾、坪石３个监测点收集的发热待查患者和蚊媒标本,均未分离出登革病毒。蚊媒监测结果表明：布雷图指数大大超过有效控制指标５;全年大部分时间布雷图指数均超过２０以上;血清学调查表明：健康人群抗体水平逐年下降。结论：存在登革热暴发流行的潜在危险。     

三元共聚重氮胶乳的研制及其应用

用无乳化剂聚合法制备了苯乙烯－甲基丙烯酸－β－羟丙酯－丙烯酸（ｓｔ－ＨＰＭＡ－ＡＡ）三元共聚胶乳。讨论了其聚合条件与影响因素。通过硝化反应与还原反应在苯乙烯的苯环上接上氨基，利用重氮化反应将登革热抗体与之相交联制成豇地病毒胶乳凝集免疫诊断试剂。试验表明该论断试剂对登革病毒以外的其它虫媒病毒无明显交叉反，最低检出抗原量达到１５ｎｇ／ｍｌ病毒蛋白水平，敏感性是血凝方法的１００倍。经临床诊断表明，该试剂     

RNAi沉默PSMA基因对前列腺癌LNCaP细胞生物学行为的影响

目的：构建LNCaP细胞PSMA基因的shRNA真核表达载体，探讨其对LNCaP细胞中PSMA基因表达的干扰作用。方法:针对PSMA mRNA序列设计合成3对编码shRNA的寡核苷酸链，退火形成双链，连接入含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的pSilencer 2.1-U6-neo真核表达载体，双酶切及测序鉴定。使用脂质体转染的方法将重组质粒导入LNCaP细胞，G418筛选后RT-PCR、Western blotting检测其对PSMA基因干扰作用，并观察对LNCaP细胞生物学行为的影响。结果:经酶切及测序鉴定，成功构建shRNA真核表达载体p-shRNA1,2,3转染LNCaP后，对细胞PSMA mRNA表达抑制率分别为33.15%、9.26%、41.97%，Western blotting结果显示对PSMA蛋白表达的抑制率分别为26.26%、6.47%、40.69%。选择抑制效率较高的p-shRNA3进行体外生长及侵袭力实验，发现干扰后对LNCaP细胞侵袭力增强, 但是对细胞生长影响不大。结论:成功构建了人PSMA基因的RNAi的真核表达载体，并在LNCaP细胞中有效地发挥了对PSMA基因表达的干扰作用，初步发现PSMA在前列腺癌的侵袭中起负向调节作用，为进一步研究PSMA的生物学功能，探索前列腺癌的发病机制奠定一定的实验基础。     

海南部分地区不明热患者斑点热立克次体血清学和病原学调查

斑点热是由斑点热群立克次体引起的蟀媒传染病。近年来调研资料表明,海南岛存在该病的自然疫源地[1,2]。由于该病多无特征性临床病征,临床上易误诊为不明原因发热。为了解海南岛斑点热的流行病学特征,探明“不明热”的病因,我们在lgu年4－8月间在海南琼中、三亚等收集了诊为不明原因发热的患者血液切份,应用R3UII：I？liP方法检测斑点群立克次体特异性核酸,结果报告如下。1材料与方法1．1标本的采集lop年4－8月间,在海南琼中大丰农场、新进农场及长征农场职工医院及三亚市人民医院收取诊为不明热的血液标本81份,液氮保存。1．2…     

前列腺特异膜抗原剪接变异体的基因结构和多态性分析

目的:了解PSMA剪接变异体的结构及其多样性，探讨前列腺癌的发生机制。 方法:应用cDNA末端快速扩增（RACE）的方法扩增剪接变异体5和3末端，并进行序列测定，分析前列腺癌组织PSMA剪接变异体的结构及其多样性。 结果:从前列腺癌组织中发现4种新的PSMA剪接变异体，与已往报道的PSMA剪接变异体相比，新发现的变异体在不同位点存在不同程度的插入及缺失。 结论:本研究所发现的新PSMA剪接变异体证实和丰富了PSMA剪接变异体的多样性，为寻求前列腺癌特异性的诊断标志物和治疗靶点提供了新的线索和思路。     

微孔杂交快速检测黄热病及乙型脑炎病毒方法的建立

聚合酶链反应(PCR)技术已广泛应用于疾病诊断，但由于临床标本复杂，常出现非特异性扩增条带或电泳拖尾现象，给结果的判定带来困难。为了探讨更加敏感、特异的流行性乙型脑炎病毒(JEV，乙脑)及黄热病病毒(YF)快速检测方法，我们分别设计了黄热及乙脑病毒的特异性包被探针及检测探针，建立了快速检测YF及乙脑病毒的微孔杂交(PCR-ELISA)方法。     

海南省琼中地区三农场斑点热血清流行病学研究

目的：了解海南省斑点热流行状况。方法：用补体结合试验，在琼中县大丰、阳江及新进３个农场的健康人群、家畜及啮齿动物中进行斑点热血清流行病学及啮齿动物种群和带蜱情况调查。结果：共检查牛血清１８份，羊血清５０份，猪血清６３份，人血清７２份，鼠血清１２０份，西伯利亚立克次体、康氏立克次体、小蛛立克次体抗体阳性率羊血清分别为４％（２／５０）、２％（１／５０）和２％（１／５０）。猪血清分别为３．１７％（２／６３）、０％（０／６３）和３．１７％（２／６３），人血清分别为１６．６７％（１２／７２）、１１．１１％（８／７２）和２．７８％（２／７２），鼠血清分别为３０．００％（３６／１２０）、１０．８３％（１３／１２０）和７．５０％（９／１２０），牛血清中未检测出上述抗体。该地区的优势鼠种为黄毛鼠、屋顶鼠、针毛鼠，带蜱率分别为１５．９１％（７／４４）、３０％（１５／５０）、３６．３６％（８／２２）。结论：海南省琼中县存在斑点热自然疫源地。