重组人肿瘤坏死因子a衍生物3a的克隆与表达

目的 :寻找具有更强抗肿瘤活性和 (或 )较低毒副作用的 TNFα突变蛋白。 方法 :应用巨引物二轮 PCR技术对rh- TNFα的第 80、90和 92位氨基酸编码的密码子进行定点突变 ,经过 DNA序列测定证实 DNA突变准确后 ,将突变基因的c DNA插入 p BL载体 ,转化大肠杆菌 DH5α,获得表达 rh- TNFα- D3a的工程菌。 结果 :经巨引物二轮 PCR获得表达 TNFα突变蛋白的基因突变 ,经序列测定结果与设计一致 ,重组蛋白表达量占细菌总蛋白 18.0 % ,大部分为可溶性 ,占 rh- TNFα- D3a总量的 6 0 %以上。重组蛋白经纯化 ,纯度 >98%。 rh- TNFα- D3a对 L 92 9细胞表现出较高的细胞毒性 ,比活性大于 5× 10 8IU / mg。与野生型的 rh- TNFα相比 ,rh- TNFα- D3a的毒性降低为野生型的 1/ 10 ,同时其保留了 TNFα的抗肿瘤活性。 结论 :rh- TNF-αD3a是一个毒性较低 ,具有较强抗肿瘤作用的衍生物     

FasL基因修饰的树突状细胞抑制GVHD的作用和机理

内质网(endoplasmic reticulum, ER)是组成细胞内膜系统的膜性细胞器之一[1],也是细胞内膜系统的发源地.内质网在真核生物细胞中不仅具有蛋白质合成、脂质合成、物质运输、信息储存及传递功能,还具有机械支持、糖类代谢和解毒作用.研究内质网膜系统的结构与功能及生物学行为对了解正常细胞生理功能和肿瘤细胞的病理机理有重要意义,也为肿瘤治疗提供新的思路.     

TRAIL诱导突变细胞凋亡的分子机理——免疫监督机制的新模型

Burnet提出免疫监督学说已经快三十年了,现在对这一理论的理解已经深入至分子水平,如MHC、TCR分子在免疫监督中的作用.随着TNF超家族和TNF受体超家族研究的深入,尤其是FasL、TNF-α和它们的受体Fas、TNFR1结构和功能及它们的信号转导途径的逐步阐明,免疫监督已从细胞免疫水平向分子免疫水平过渡.本文在国内外对TRAIL及其受体研究的基础上,提出了一个免疫监督的新模型:突变细胞比正常细胞缺少某些细胞膜表面信号从而被机体凋亡信号所识别,机体利用凋亡信号诱导突变细胞凋亡的方式清除它们.这一机制的提出可能会补充免疫监督学说.     

Par-4特异诱导肿瘤凋亡及其机制的研究新进展

前列腺凋亡反应基因-4(prostate apoptosis response gene-4,par-4)基因是最早在前列腺癌细胞中发现,这个基因在正常细胞和肿瘤细胞中均可表达,其编码产物前列腺凋亡蛋白-(prostate apoptosis response protein,Par-4)可通过内源性和外源性途径选择性的诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞没有影响。Par-4发挥作用可包括内源性Par-4裂解和磷酸化、内源性Par-4转运Fas/Fas L并激活Fas/Fas L促凋亡通路、及外源性的Par-4和细胞膜上的GPR78结合诱导细胞凋亡等过程。特别是Par-4的外源性途径在肿瘤的靶向治疗中有很重要的应用价值。本文就Par-4诱导凋亡机制及外源性Par-4在肿瘤治疗方面的最新研究进展进行综述。     

三联脆组基因在胰腺癌及癌旁组织中mRNA表达的研究

胰腺癌的发病率呈逐年上升的趋势。由于其较早转移特性、缺乏有效的早期诊断以及术后易复发性,胰腺癌患者术后5年生存率很低,预后较差[1]。随着分子生物学的发展,胰腺癌的发生被认为是癌基因(如ｃｅｒＢ3,Ｋｒａｓ等)激活及抑癌基因(如ｐ53,ｐ16等)失活的复杂过程。最近Ｏｈｔａ等[2]在染色体经常丢失部位3ｐ克隆出三联脆组(ＦＨＩＴ)基因,定位于3ｐ14.2,其ｃＤＮＡ长1095ｂｐ,含10个外显子,59外显子为编码序列,在全身各器官组织中都有低水平的表达,而在肺癌、头颈部肿瘤及消化道肿瘤中存在较高频率的异常,主要以缺失为主,点突变罕见,并被拟…     

核酸适配体对岩沙海葵毒素细胞毒性保护作用

目的 核酸适配体（Aptamer）是利用指数富集的配基系统进化技术（SELEX）筛选得到的单链DNA或RNA片段,能高亲和、高特异性地与靶标分子结合。岩沙海葵毒素（Palytoxin,PLTX）是目前已知的最具毒性的非蛋白质类天然海洋毒素之一。基于核酸适配体对PLTX的特异性靶向功能,探究核酸适配体对细胞毒性的保护作用。方法 采用细胞毒性实验分别检测比较了PLTX对NIH-3T3、CHO-K1、HACAT三种不同细胞的毒性作用,以及适配体拮抗PLTX的细胞毒作用。采用红细胞溶血实验检测PLTX对人红细胞的溶血作用,以及适配体抑制PLTX的溶血活性作用。结果 三种细胞毒性曲线结果显示,HACAT细胞的ID50约为3.42ng/ml,CHO-K1细胞的ID50约为1.06×10-2ng/ml,NIH-3T3细胞的ID50约为1.39×10-2ng/ml。在不同浓度下,PLTX组与PLTX:aptamer=1:1组进行比较,结果显示适配体抑制PLTX对HACAT细胞的毒性作用（P<0.05）。在50nM PLTX浓度下,PLTX组与PLTX:aptamer=1:1组进行比较,结果显示适配体抑制PLTX对人红细胞溶血活性作用（P<0.05）。结论 实验结果表明HACAT细胞对2.5×10-3~2.5×102ng/ml浓度范围的PLTX毒性作用较敏感;核酸适配体对HACAT细胞具有细胞毒性保护作用。在50nM PLTX浓度下,相应浓度适配体能够有效抑制PLTX对人红细胞的溶血活性,起到显著细胞保护作用。     

血小板活化因子乙酰水解酶融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的:获得血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)全长编码基因并在GST原核表达系统中表达.方法:通过RT-PCR方法,从正常人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出PAF-AH全长编码基因,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-3,转化大肠杆菌BL21并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化.所得纯化蛋白以SDS-PAGE及Western印迹方法鉴定,并进行酶活性测定.结果:获得了PAF-AH基因,序列分析与GenBank数据库中序列一致.SDS-PAGE及Westem印迹结果显示,诱导表达出可溶性的融合蛋白,其相对分子质量与预期相符.纯化蛋白经Western印迹检测能够被特异性抗体所识别,具有免疫学活性;酶活性检测证实其具有特异的水解PAF的活性.结论:本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的PAF-AH蛋白.     

吲哚胺2，3-二氧化酶基因修饰的DCs对小鼠移植物抗宿主病的抑制作用

目的:探讨小鼠树突状细胞(dendritic cells,DCs)转染吲哚胺2,3-二氧化酶(indolamine 2,3-dioxygenase,IDO)基因后对移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)的抑制作用。方法:用携带IDO基因的重组腺病毒感染BALB/c小鼠来源的树突状细胞,后者与C57BL/6小鼠骨髓移植物共培养,将经过处理的骨髓移植给BALB/c小鼠(C57BL/6→BALB/c小鼠GVHD模型,H-2~h→H-2~d),观察、比较各组GVHD表现(包括GVHD评分、生存期、病理学改变),并行嵌合体检测及观察混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)。结果:致死剂量照射的受体小鼠接受经IDO处理的骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)后,未出现明显的GVHD反应,生存期显著延长,3个月时生存率大于80%;对照组均在移植后2周左右出现明显的GVHD表现,生存期未超过1个月。IDO-DC治疗组未出现明显的组织病理学损害;3个月时IDO-DC治疗组仍然保持比较高的嵌合;IDO-DC组的T细胞对C57BL/6、BALB/c淋巴细胞的反应性与对C3H淋巴细胞反应性相比显著降低(P<0.05)。结论:经IDO基因修饰的DCs可以选择性去除骨髓移植物中异基因反应性T细胞,从而特异性地抑制GVHD并能及早地免疫重建。     

三联脆组蛋白在胰腺癌中的表达及临床意义

目的 :研究胰腺癌中三联脆组 (fragilehistidinetriad ,FHIT)蛋白表达状况及其与临床、病理指标的可能关系。方法 :选择 4 4例经病理证实的胰腺癌蜡块标本 ,采用兔抗人FHIT的蛋白抗体和枸橼酸 -微波 -SP免疫组化方法检测其中FHIT的表达并分析与年龄、病理分级、临床分期及 2年生存率的关系。结果 :胰腺癌组织中FHIT表达阳性 2 3例 (5 2 .3% ) ,FHIT表达阴性 2 1例 (47.7% )。FHIT阴性表达在胰腺癌临床分布为 :Ⅰ～Ⅱ期 9/ 2 8,Ⅲ～Ⅳ期 14 / 16 ,差异显著 (P <0 .0 1) ;在无淋巴转移组为 12 / 30 ,有淋巴转移组为 11/ 14 ,差异显著 (P <0 .0 5 ) ;在生存时间≤ 2年组为 19/ 31,>2年组为 4 / 13。结论 :人胰腺癌标本FHIT的表达和年龄、性别、肿瘤大小及病理分级无明显相关性 ,但和有无淋巴转移、临床分期及 2年生存率显著相关。FHIT的低表达和胰腺癌的发生发展密切相关 ,并可能是判断胰腺癌预后的重要指标     

中国姥鲨软骨源溶菌酶样分子的分离纯化、部分氨基酸序列测定及体内抗肿瘤活性研究

用含0.02mol/L MES的1mol/L盐酸胍抽提新鲜中国姥鲨软骨组织,抽提物经Mr30000 PTTK膜超滤、 Sephacryl S-200和Superdex 75柱层析获得1种新的Mr为15200的高纯度蛋白质(Sp15),N-末端序列测定表明其与多种哺乳动物来源的溶菌酶具有相关性,并在体外具有显著的溶菌酶活性,其比活性高达223000U/mg ;Sp15在10μg/ml浓度下,可显著抑制血管内皮细胞的增殖,其抑制率高达75%;在8mg/kg剂量下,对小鼠移植的S180肉瘤的抑瘤率达33.3%,并可显著延长荷 S180 腹水瘤小鼠的生存时间.