小鼠B7-H4慢病毒表达载体的构建及对脾细胞增殖的影响

目的:构建小鼠B7-H4(mB7-H4)慢病毒表达载体并观察B7-H4蛋白对脾细胞增殖的影响。方法:从BALB/c小鼠肺脏中克隆B7-H4基因,构建表达载体mB7-H4-EGFP,酶切后克隆入慢病毒表达载体pCDH1-MCS1-EF1-Puro中,命名为pCDH1-mB7-H4-EGFP;以包含起始密码和多克隆位点的寡核苷酸取代mB7-H4作为对照载体pCDH1-Control-EGFP。分别与包装载体混合物一起经LipofectamineTM2000转染入293T细胞包装成病毒颗粒,感染293T细胞。pCDH1-mB7-H4-EGFP重组慢病毒感染的293T细胞分别与BALB/c、C57BL/6、BALB/c∶C57BL/6(1∶1)小鼠脾细胞混合培养,用MTT法检测其对脾细胞增殖的影响,对照为pCDH1-Con-trol-EGFP重组慢病毒感染的293T细胞进行的相同处理。结果:mB7-H4被成功克隆,测序证实与GenBank的mRNA核酸序列2个核苷酸有差异,但与其编码的氨基酸一致。pCDH1-mB7-H4-EGFP慢病毒表达载体被成功构建。mB7-H4蛋白表达在293T细胞表面,与对照相比,对BALB/c、C57BL/6、BALB/c∶C57BL/6(1∶1)小鼠脾细胞增殖均具有明显抑制作用。结论:成功构建小鼠B7-H4慢病毒表达载体,感染293T细胞后表达出对脾细胞增殖具有抑制活性的mB7-H4膜表面蛋白。     

研究生分子生物学实验教学模式的探索

分子生物学实验课程是医学研究生教学中一门应用性很强的基础课程,根据该院研究生实验课程的情况,就如何培养学生基本的实验技能、学生动手能力、科研创新能力、学生分析问题和解决问题的能力等方面的教学经验进行了总结。     

小干扰RNA抑制bcl-xL表达对食管癌细胞化疗敏感性的影响

目的探讨凋亡抑制分子bcl-xL表达下调对食管癌细胞化疗敏感性的影响。方法根据人bcl-xL基因序列设计和合成3对小干扰RNA,将其转染于体外培养的人食管癌细胞株Eca-109,通过RT-PCR和Western-blotting检测bcl-xL的表达情况,筛选出对bcl-xL表达抑制作用最强的小干扰RNA,通过MTT法检测小干扰RNA转染细胞和对照细胞在不同浓度顺铂和紫杉醇作用下的细胞增殖抑制率,计算出半数抑制浓度IC50值并进行对比分析。结果食管癌细胞转染靶向bcl-xL的3种小干扰RNA后,bcl-xL mRNA和蛋白表达均显示出不同程度下调,其中siRNA1对癌细胞bcl-xL表达的抑制作用最强。siRNA1转染食管癌细胞后可使顺铂和紫杉醇对癌细胞的IC50值由转染前的（31.4±4.3）μmol/L和（35.3±6.1）μmol/L下降至转染后的（8.4±3.3）μmol/L和（15.1±4.7）μmol/L（P〈0.01）。结论小干扰RNA抑制bcl-xL表达可增强食管癌细胞对顺铂和紫杉醇化疗的敏感性。     

小干扰RNA抑制bcl-xL表达对食管癌细胞化疗敏感性的影响

目的 探讨凋亡抑制分子bcl-xL表达下调对食管癌细胞化疗敏感性的影响.方法 根据人bcl-xL基因序列设计和合成3对小干扰RNA,将其转染于体外培养的人食管癌细胞株Eca-109,通过RT-PCR和Western-blotting检测bcl-xL的表达情况,筛选出对bcl-xL表达抑制作用最强的小干扰RNA,通过MTT法检测小干扰RNA转染细胞和对照细胞在不同浓度顺铂和紫杉醇作用下的细胞增殖抑制率,计算出半数抑制浓度IC50值并进行对比分析.结果 食管癌细胞转染靶向bcl-xL的3种小干扰RNA后,bcl-xL mRNA和蛋白表达均显示出不同程度下调,其中siRNA1对癌细胞bcl-xL表达的抑制作用最强.siRNA1转染食管癌细胞后可使顺铂和紫杉醇对癌细胞的IC5o值由转染前的(31.4±4.3)μmol/L和(35.3±6.1)μmol/L下降至转染后的(8.4±3.3)μmol/L和(15.1±4.7)μmol/L(P＜0.01).结论 小干扰RNA抑制bcl-xL表达可增强食管癌细胞对顺铂和紫杉醇化疗的敏感性.     

反义ATM多核苷酸对喉鳞状细胞癌ATM mRNA、蛋白影响的体外研究

目的:设计反义ATM多核苷酸作用于喉鳞状细胞癌以探讨其对ATM mRNA、蛋白表达的影响。方法:用Westernblot和real-time quantitative PCR对AS-ODNs、Sen-ODNs、Mis-ODNs、lipo与hep-2组的ATM蛋白和ATM mRNA进行分析。结果:AS-ODNs、Sen-ODNs、Mis-ODNs、lipo与hep-2组(对照组)的ATM蛋白及ATM mRNA相对表达量以AS-lipo组最低,分别为(48.14±5.53)%和(11.03±2.51)%,AS组与Sen、Mis、lipo、hep-2组比较有差异(P<0.05)。结论:反义ATM多核苷酸降低了喉鳞状细胞癌细胞中ATM mRNA、蛋白的表达,其可能使喉鳞状细胞癌细胞对放射治疗的敏感性增强。     

用bcl-2反义mRNA和dsRNA抑制SP2/O生长的比较研究

目的本研究旨在比较靶向bcl-2基因的反义mRNA和dsRNA对SP2/O细胞生长的抑制作用.方法采用MTT法,免疫荧光和免疫细胞化学技术,克隆形成试验及分光光度计测定细胞总蛋白含量等方法,分析比较了经体外转录获得的bcl-2反义mRNA利LdsRNA抑制SP2/O细胞生长、bcl-2特异性蛋白和总蛋白表达及其克隆原性的作用.结果检测结果证实bcl-2反义mRNA和dsRNA对上述指标均有抑制作用,两者比较dsRNA的抑制作用更强,持续时间也较长,作为对照的bcl-2正义RNA对上述指标无显著增强作用.提示LdsRNA对bcl-2高表达的肿瘤细胞有更强的抑制和杀伤作用,因此有可能用于这些肿瘤的临床治疗.     

N ek8在食管鳞癌中的表达及意义

目的：探讨食管鳞癌组织和细胞系中Nek8的表达及其与食管鳞癌临床病理特征和术后生存的关系。方法采用RT‐PCR法检测食管鳞癌细胞系Eca109细胞、2例配对的食管鳞癌组织和癌旁黏膜上皮中Nek8 mRNA表达情况;应用免疫组织化学法检测Nek8蛋白在食管鳞癌组织芯片中的表达情况,并结合临床病理资料和生存率进行统计学分析。结果 Nek8 mRNA在Eca109细胞、2例食管鳞癌患者的癌组织均有表达,而癌旁食管黏膜上皮中均未见明显的表达。组织芯片结果示N ek8蛋白主要表达于细胞质,在78例配对的标本中,Nek8在食管鳞癌组织中的表达显著高于其在癌旁黏膜组织的表达（P＝2．16E‐13）。其表达与肿瘤大小有关（P＝0．008）,而与性别、年龄、分化程度、浸润深度、淋巴结转移无关（P＞0．05）。生存分析显示高表达和低表达Nek8的患者生存率差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 Nek8在食管鳞癌组织和细胞中表达上调,可能参与了食管鳞癌的发生、发展,可作为诊断的标志物和治疗的靶点。     

S1P5对食管癌细胞Eca109黏附能力的影响

目的研究S1P5对食管鳞癌Eca109细胞黏附能力的影响。方法从人正常食管黏膜上皮克隆S1P5基因,构建表达载体S1P5-EGFP,转染Eca109细胞,经G418筛选,获得S1P5-EGFP/Eca109稳定细胞株。以对照载体Control-EGFP转染的Eca109细胞作为对照,荧光显微镜下观察细胞的形态,用黏附试验评价其黏附能力。结果成功构建S1P5-EGFP和Control-EGFP载体并转染Eca109细胞获得稳定细胞株。S1P5表达于细胞膜并使细胞略呈梭形改变。S1P5过表达致Eca109细胞黏附能力明显低于对照（P〈0.05）,并且不受其配体1-磷酸鞘氨醇（S1P）的影响。结论 S1P5组成性抑制Eca109细胞的黏附能力,食管癌细胞可能通过下调S1P5的表达增强其黏附。     

表皮生长因子对食管鳞癌细胞Eca109 细胞周期及其 调控因子的影响

目的:探讨表皮生长因子(EGF)对食管鳞癌细胞Eca109细胞周期及相关调控因子的影响。方法:20 ng/ml重组人EGF(rh EGF)作用于血清饥饿的Eca109细胞24 h,采用流式细胞术检测EGF对Eca109细胞周期的影响,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测p21CIP1/WAF1(p21)、p27KIP1(p27)mRNA的表达情况,Western blot检测p21、p27蛋白的表达情况。结果:EGF组和对照组G1期细胞所占比例分别为(54.90±0.82)%和(65.94±0.74)%(P0.01);qRTPCR结果显示p21 mRNA表达水平EGF组明显高于对照组,p27 mRNA表达水平EGF组明显低于对照组(P0.01);Western blot结果显示,p21蛋白表达水平EGF组明显高于对照组,p27蛋白表达水平EGF组明显低于对照组(P0.01)。结论:EGF有利于Eca109细胞从G1期过渡到S期,促进细胞增殖,可能与调节p21、p27的mRNA和蛋白的表达相关。