人fadd基因cDNA的克隆和诱导舌癌细胞凋亡的研究

目的：观察人fadd基因对舌癌（Tca-8113）细胞的凋亡诱导作用。方法：用反转录PCR获取人fadd基因，将基因克隆入真核表达载体pcDNA和pIRES2和pIRES2-EGFP中，脂质体法转染舌癌细胞，通过细胞计数、荧光显微镜及电镜观察、流式细胞仪等检测技术被转染细胞的生长及其凋亡状况。结果：成功获取了人fadd基因。与对照组相比，在转染1-3d内，fadd基因的表达导致舌癌细胞存活数目减少，大量细胞发生凋亡。结论：人fadd基因可以诱导转染的舌癌细胞发生凋亡。     

转运结构域的研究进展

利用非病毒载体转运目的基因时 ,具有转运结构域的蛋白质或多肽片段可以有效地促进外源效应分子进入细胞浆 ,发挥其效应。这些转运结构域广泛的存在于毒素蛋白、病毒蛋白、转录因子、同源结构域及合成肽当中。     

人抗HBsAg单链抗体-Tat融合基因的构建、表达及表达产物的活性鉴定

目的: 构建人抗HBsAg单链抗体-Tat蛋白转导结构域(ScFv-Tat)融合基因,在大肠杆菌中进行表达,并分析ScFv-Tat融合蛋白的活性及内化情况. 方法: 设计引物扩增人抗HBsAg单链抗体基因,克隆入含有蛋白转导结构域Tat序列的原核表达载体pTAT-HA,在大肠杆菌BL2l(DE3)LysS内诱导融合蛋白表达. 表达产物用SDS-PAGE及Western blot鉴定,用亲和层析柱纯化. 间接ELISA和ELISA竞争抑制实验分析ScFv-Tat融合蛋白的亲和活性,将纯化蛋白与HBsAg阳性或阴性肝癌细胞共孵育后,免疫细胞化学染色分析ScFv-Tat融合蛋白的结合及内化情况. 结果: 成功地构建了人抗HBsAg单链抗体-Tat融合蛋白的原核表达载体,在IPTG诱导下获得了表达,表达的ScFv-Tat融合蛋白具有与HBsAg结合的活性,并且能够特异性内化入HBsAg阳性肝癌细胞. 结论: 单链抗体与Tat蛋白转导结构域融合后,实现了ScFv-Tat融合蛋白的特异性内化,为该单链抗体的进一步应用奠定了基础.     

容量调控氯通道基因siRNA表达载体的构建及其沉寂效应检测

目的:构建针对容量调控氯通道基因(CLC3)的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对CLC3基因的干扰作用. 方法:设计CLC3靶向的发夹状siRNA,据此设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPER载体,转化扩增后进行序列测定. 用脂质体转染法转染胃癌细胞SGC7901,通过RT-PCR、间接免疫荧光检测CLC3基因表达水平的变化. 结果:把针对CLC3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pSUPER载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确,稳定转染人胃癌细胞SGC7901后, RT-PCR、间接免疫荧光检测表明,CLC3基因的表达水平明显降低. 结论:构建了针对CLC3基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制CLC3基因表达.     

hTERT siRNA表达载体的构建及对转染的HeLa细胞生长抑制作用

目的:通过RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达,探讨干涉后对肿瘤细胞生长的抑制作用. 方法:根据人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA编码序列,设计RNA干涉靶点,构建siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并转染HeLa细胞,通过RT-PCR法观察重组质粒转染肿瘤细胞后端粒酶mRNA、蛋白含量及细胞生长情况. 结果:构建的siRNA表达载体可以使HeLa细胞端粒酶逆转录酶mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度减慢. 结论:成功构建了针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中端粒酶的表达,并引起细胞生长抑制.     

人截短型凋亡诱导因子AIF△1-480的表达对HeLa细胞的促凋亡作用

目的: 观察人截短型AIF(AIF△1-480)基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用. 方法: 在人截短型AIF(AIF△1-120)基因克隆成功的基础上,进一步改造,构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域(1-480位氨基酸)编码序列的人截短型AIF(AIF△1-480)基因.将其克隆入pIRES2-EGFP绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察、电镜观察等方法,检测目的基因在转染细胞中的表达以及对转染细胞形态的影响.结果: 成功构建了人截短型AIF(AIF△1-480)基因的真核表达载体.转染细胞后,可检测到人截短型AIF(AIF△1-480)分子的表达.转染后48 h,可观察到表达人截短型AIF(AIF△1-480)分子的细胞呈现典型的凋亡特征.结论: 人截短型AIF(AIF△1-480)基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡.     

考马斯亮兰G—250蛋白质定量测定法及其应用

1976年Bradford 首先建立了应用考马斯亮兰G-250(Coomassie Brillant Blue G-250,以下简称G-250)定量测定蛋白质的比色法。该法简单、迅速、感度高、重复性好、干扰物质少,应用越来越广。近年来,对其作用原理有了进一步认识,方法上也有不少改进。本文拟就Bradford 法及研究进展作一综述。一、G-250与蛋白质的呈色原理Reis-ner 等提出G-250的颜色变化是H~+浓度的函数。Compton 等根据G-250溶液酸碱滴定时其可见光范围吸收光谱的变化,提出G-250以三种形式存在,即阳离子、兼性离子和阴离子。     

重组tBid融合蛋白基因的构建及其在HeLa细胞中的分泌表达

目的:构建重组的Immuno-tBid基因,并检测其在HeLa细胞中的分泌表达。方法:将肿瘤表面抗原HER2的单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PE253-364aa)和tBid基因连接,并在5'端连接前导肽基因,构建成Immuno-tBid(e23sFv-PEII-tBid61/tBid76)基因。将其克隆到pCMV载体并转染HeLa细胞,G418筛选获得阳性克隆,Genomic-PCR和RT-PCR分别扩增相应的重组基因片段。建株的HeLa细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测。并通过间接免疫荧光染色和细胞计数观察建株的HeLa细胞生长和形态变化。结果:成功构建了重组的Immuno-tBid基因的真核表达载体(pCMV-e23sFv-PEII(253-364)-tBid61/tBid76)。稳定转染HeLa细胞,获得G418抗性的阳性HeLa细胞克隆,Genomic-PCR检测证实目的基因已整合到细胞基因组中。RT-PCR检测表明目的基因在RNA水平上的表达。细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测,证实建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。间接免疫荧光染色和核染色结果显示,分泌Immuno-tBid蛋白的HeLa细胞呈标准的S型曲线生长,形态正常。结论:成功构建了重组的Immuno-tBid基因,建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。     

何杰金氏病中抗细胞凋亡基因bcl－2翻译产物的定位

采用高敏感多重ＰＡＰ免疫细胞化学技术，研究抗细胞凋亡基因ｂｃｌ－２在淋巴结何杰金氏病中的表达与分布。结果表明，２１例中有７例（３３％）可检出ｂｃｌ－２蛋白阳性的Ｒｅｅｄ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（Ｒ－Ｓ）细胞；其中２例（混合细胞型）尚含大量反应性淋巴滤泡，其生发中心也呈阳性反心。相反４例作为阳性对照的炎性淋巴滤泡增生中，ｂｃｌ－２蛋白主要分布于富含长寿命（ｌｏｎｇ－ｌｉｖｅｄ）Ｂ细胞的套区（ｍａｎｔｌｅｚｏｎｅ），而生发中心则均为阴性。结果提示，ｂｃｌ－２基因高表达介导的细胞凋亡障碍可能与Ｒ－Ｓ细胞发生有关。