重组人淋巴细胞功能相关抗原3-抗体融合蛋白质量控制方法与质量标准研究

研究建立重组人淋巴细胞功能相关抗原3-抗体融合蛋白(rhLFA3-IgG1)质量控制方法和质量标准。采用针对Jurkat细胞表面CD2分子的竞争结合试验测定融合蛋白的体外活性，以分子筛和离子交换色谱分别确定制品纯度，将制品还原、羧甲基化后再以胰蛋白酶裂解并经反相高效液相色谱进行肽图分析，采用ELISA法分别测定蛋白A与CHO宿主细胞蛋白残留量。建立了重组人淋巴细胞功能相关抗原3-抗体融合蛋白生物学活性、理化特性与残留杂质等质量控制方法和质量标准。所建立的质量控制方法和质量标准具有保证产品安全有效、质量可控的特点，可用于重组人淋巴细胞功能相关抗原3-抗体融合蛋白(rhLFA3-IgG1)的质量控制与产品检定。     

重组人干扰素αdb质量肽图分析及二硫键定位

目的：液质联用绘制重组人干扰素αlb的质量肽图并鉴定二硫键位点。方法：LC-MS联用绘制重组人干扰素αlb的胰蛋白酶酶切质量肽图；对比特定肽段的实测相对分子质量与理论相对分子质量初步定位二硫键，对比烷基化及还原烷基化处理后特定肽段实测相对分子质量的变化确证二硫键位点。结果：重组人干扰素αlb的质谱测定相对分子质量为19382．50，与理论相对分子质量19382．18一致，其质量肽图中共发现16个匹配肽段，有3个理论酶切片段（单一氨基酸：Lys135、Lys165、Glu166）未发现，氨基酸覆盖率为98．2％。通过分析胰蛋白酶酶切质量肽图，发现主要存在2种二硫键连接方式：Cys29-Cys139、Cys86-Cys99，同时还存在少量其他二硫键连接方式，如：C1-C99。结论：质量肽图可作为一种对重组蛋白制品进行质量控制的手段，并可定位蛋白中的二硫键。     

长效蛋白和多肽类药物的研发现状

蛋白质和多肽类药物是生物技术药物中重要的一类,如重组人IFN、重组人粒细胞集落刺激因子、重组人IL等.然而这些药物体内半衰期相对较短,临床上需要反复给药以维持血药浓度稳定,从而给患者带来不便和经济负担,研发长效蛋白和多肽类药物则是一个改良趋势.长效药物是半衰期延长、药效得到改善的一类新型药物,是在原有药物基础上进行修饰获得,它的研制成功降低了临床给药频率,提高了患者的依从性.     

肝毒性生物标志物研究进展

 目的 综述近年来肝毒性生物标志物的研究现状和最新进展。 方法 通过查阅与肝毒性生物标志物相关的国内外文献报道和美国FDA相关指导原则,对传统的和新发现的肝毒性标志物的研究现状和最新进展进行总结和分析。 结果与结论 近年来,肝毒性生物标志物的研究已取得了很大的进步,许多新的肝毒性生物标志物在灵敏度和特异性方面都超过了传统肝毒性生物标志物,但是目前肝毒性生物标志物的研究中仍存在许多问题,还需要开展更多的研究和验证工作。     

重组抗人血小板GPⅡb/Ⅲa嵌合单抗F(ab′)_2在Beagle犬体内药动学

目的研究了重组抗人血小板GPIIb/Ⅲa嵌合单抗F(ab′)2经静脉单次给药后在Beagle犬中的药动学。方法按不同时间点采血,分离血浆,采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定犬血浆中嵌合单抗F(ab′)2的浓度,根据非房室统计矩模型进行曲线拟合并计算药动学参数。结果Beagle犬分别静脉单次注射高、中、低(1.2,0.8,0.4mg.kg-1)后,t1/2分别为(7.35±0.65),(8.28±0.68)和(7.03±3.26)h,CLs与Vss随着剂量的减小发生增加的变化,血药浓度-时间曲线下面积AUC0-inf分别为(2453.70±371.59),(1097.64±142.11)和(362.63±169.12)μg.h.L-1,剂量之比为3:2:1,对应的AUC0-inf比值为6.8:3:1,剂量与AUC成正相关性,相关系数R2=0.9714,但是AUC0-inf的增加量大于剂量的增加量。结论在本实验的剂量范围内,剂量与AUC0-inf成正相关性,AUC0-inf的增加量大于剂量的增加量,预示在以上剂量范围内嵌合单抗F(ab′)2在Beagle犬血浆中的浓度变化可能呈非线性药动学规律;动物性别对药动学参数无显著性影响。     

不同血清型腺相关病毒载体组织表达差异的研究进展

重组腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）具有弱免疫源性、可介导治疗基因长期稳定表达等优势,使其被公认为基因治疗的理想载体之一。目前临床研究广泛采用的AAV-2血清型载体对部分靶器官和组织的转导效率不十分理想,同时AAV-2中和抗体会干扰此型载体介导的基因转移效率。为了克服上述不足,众多学者将开展了针对其他7种天然血清型AAV（AAV-1,AAV-3至AAV-8）的研究。研究表明这些新型载体的组织亲嗜性和针对同一靶器官的转导效率与AAV-2不同,并且规避了AAV-2免疫应答对载体介导基因转移效率的影响。在视网膜中AAV-1、AAV-5的表达检出较早,表达水平高于AAV-2;AAV-5在胰腺的表达水平也明显高于AAV-2;AAV-4,AAV-5在中枢神经系统的转导效率和表达水平均显著高于AAV-2,并且表达不仅局限于注射部位;AAV-1,3,4,5,7型载体在肌肉的表达水平均超过AAV-2,其中又以AAV-1最为显著;肺组织中AAV-1,5,6型的表达较高,其中AAV-5表达量又高于AAV-1和AAV-6;而肝脏表达水平由高到低的先后顺序为AAV-1〉AAV-5〉AAV-3〉AAV-2。这些研究均提示了新型AAV载体在基因治疗研究和应用领域的巨大潜力。     

重组人纽表位肽12的胃蛋白酶切肽图分析方法的研究

采用反相高效液相色谱法建立重组人纽表位肽12的标准肽图分析法，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A液：0.1％TFA的水溶液，流动相B液：0.1％TFA的乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～70min内B％由0％增至70％。结果3批重组人纽表位肽12样品的反相高效液相色谱图完全一致，与重组人纽表位肽12理化对照品的肽图比较，完全吻合，同时胃蛋白酶并不干扰肽图的测定，该法准确度高、重现性好，可用于重组人纽表位肽12的质量控制。     

重组腺相关病毒2型/人凝血因子IX的质量研究重组腺相关病毒2型/人凝血因子IX的质量研究

目的研究并建立重组腺相关病毒2型/人凝血因子IX(recombinant adeno-associated virus type 2/human blood coagulation factor IX,rAAV-2/hFIX)的质量标准。方法采用PCR法确认病毒所携带的重组核酸结构和测定辅助病毒(helper virus)和野生型腺相关病毒（wtAAV）的残留片段。SDS-PAGE电泳测定病毒外壳蛋白分子量及纯度，TSK gel SP-NPR阳离子交换柱系统测定病毒颗粒纯度。以斑点杂交法测定病毒颗粒数。一期法于IX因子基因剔除小鼠体内测定rAAV-2/hFIX生物学活性，并通过ELISA法测定感染BHK-21细胞后hFIX的表达量。结果PCR法确证病毒的重组核酸结构与构建预期相同；在1×10⁷ VG的rAAV-2/hFIX颗粒中，残留辅助病毒的基因片段数少于1个拷贝；在1×10⁸ VG的rAAV-2/hFIX颗粒中，野生型AAV-2基因片段数少于1个拷贝。病毒颗粒及外壳蛋白纯度均大于98%，病毒颗粒数大于1.0×10₁₅VG·L^-1(virus genome·L^-1)。IX因子剔除小鼠肌肉注射病毒后21 d，小鼠血液中人凝血因子IX活性达到大于正常人因子IX活性的15%，IX因子的体外表达水平大于20.0 μg·L^-1。其他各项检测指标均符合规定。结论建立了rAAV-2/hFIX的质量标准，用于控制产品质量。     

EV71疫苗诱导小鼠CD4~+ T细胞受体Vβ17基因家族克隆化改变

目的分析EV71疫苗诱导BALB/c小鼠CD4+TCR Vβ基因家族克隆化改变,探讨EV71疫苗免疫机制。方法采用TCR克隆化检测试剂盒和基因扫描技术对EV71疫苗诱导的BALB/c小鼠CD4+TCRVβ基因家族克隆化进行分析,并结合ELISPOT方法、Luminex技术和体外微量中和试验研究EV71疫苗诱导的细胞免疫和体液免疫应答情况,探讨EV71疫苗免疫机制。结果通过对小鼠CD4+TCR Vβ1-20克隆化检测,发现免疫组的Vβ17基因家族出现单克隆或寡克隆改变,对照组Vβ17为多克隆化,未见克隆化改变。免疫组小鼠脾MNC(去除CD8+)IFN-γ和IL-6的分泌水平较对照组显著增高(P均<0.01),血清EV71中和抗体应答均为阳性。进一步测序发现,免疫组Vβ17的CDR3区氨基酸序列为TASQNTLY。结论成功筛选出EV71疫苗诱导BALB/c小鼠CD4+TCR特异性改变的Vβ基因家族为Vβ17,与MHC-EV71抗原肽特异性结合的CDR3区氨基酸序列为TASQNTLY。     

鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基(GP1)对体外培养人食管癌(ECa109)细胞增殖的影响

本文报告鬼臼毒素的半合成化合物鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基(GP1)对体外培养人食管癌细胞增殖的抑制作用。用0.05,0.2和1μg/ml的GP1处理细胞72h,平均抑制率分别为12.3％42.5％和60.3％,1μg/ml以上时,抑制率几乎不再增加。GP1抑制细胞增殖的作用与处理时间有关,其对细胞克隆形成率也有明显抑制作用。而在0.2—20μg/ml范围内细胞相对增殖存活率无明显差别。用0.2,1,5μg/ml处理细胞24h或48h检验有丝分裂指数,结果表明GP1对细胞有丝分裂指数均有升高作用。本文还对GP1抑制细胞增殖和升高细胞有丝分裂指数的关系进行了讨论。