原代培养人肝细胞体外乙型肝炎病毒感染和乙型肝炎病毒表面抗原黏附模型初探

目的研究建立人肝细胞体外乙型肝炎病毒（HBV）感染模型和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）黏附模型，为后期研究小分子抗体Fab的作用打下基础。方法体外原代培养人肝细胞，对人原代肝细胞进行HBsAg黏附实验及HBV感染实验。采用正常人胎肝细胞系（L-02）及鼠原代肝细胞进行实验对照。倒置相差显微镜下观察细胞形态，生化法检测其白蛋白分泌功能。免疫组化法检测HBsAg黏附情况和HBV感染肝细胞内HBsAg的表达。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肝细胞感染HBV后HBsAg的持续表达。PCR检测肝细胞内HBV复制中间体-闭合环状双链DNA（cccDNA）。结果人原代肝细胞体外培养达2周以上。HBsAg黏附实验检测到HBsAg可黏附于人原代肝细胞、L-02、鼠原代肝细胞胞膜。HBV体外仅感染人原代肝细胞，从第2天起即可检测到细胞培养上清中存在HBsAg，并持续到观察结束第16天，免疫组化检测人原代肝细胞内HBsAg呈阳性；PCR检测到人原代肝细胞内存在HBV—cccDNA，而L—02及鼠原代肝细胞实验检测结果均为阴性。结论人原代肝细胞体外分离培养成功，HBsAg黏附和HBV感染模型初步建立于人原代肝细胞。     

转录因子SP1诱骗性寡核苷酸对猪血管内皮细胞α半乳糖苷链表达的影响

目的:探讨转录因子SP1诱骗性寡核苷酸(decoy ODN)对猪血管内皮细胞系(SV-40-PED)膜蛋白α半乳糖苷链(αGal)表达的影响。方法:SP1诱骗性寡核苷酸转染猪血管内皮细胞系,细胞爬片后荧光显微镜下观察αGal抗原表位的表达;蛋白印迹法(Western blot)检测蛋白表达情况;RT-PCR法检测SV-40-PED转染前后α1,3半乳糖转移酶(α1,3GT)mRNA。结果:荧光显微镜下细胞爬片可见转染组(decoy ODN组)细胞膜荧光表达明显减弱,部分部位可见点状荧光缺损。Western blot显示decoy ODN/PED的αGal相对吸光度值为48.2±0.9,仅为空转染组(只含有转染试剂oligofectamine)91.6±1.7的52.6%(P<0.05)。转染组α1,3GT基因异构体的mRNA表达量(异构体1为0.42±0.20;异构体2为0.27±0.12)显著低于空转染组(异构体1为0.72±0.17;异构体2为0.50±0.19;P<0.05),但错配组(错义decoy ODN组)及空转染组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:SP1 decoy ODN可以靶向性抑制猪血管内皮细胞系αGal基因的表达。     

腋窝Paget病一例

<正>乳房外Paget病(extramammary Paget’s disease,EMPD)是一种罕见的恶性肿瘤,又称乳房外湿疹样癌。因EMPD的发病率较低,临床表现与湿疹相似,所以经常被误诊。EMPD好发于大汗腺分布的部位如外生殖器,少数见于会阴、肛周和腹股沟等部位,腋窝和外耳道等病变部位在临床中更为少见。本文对1例腋窝Paget病作相关探讨分析。     

重组人抗HBsAg-Fab阻断肝移植后HBV再感染的体外研究

目的:研究重组合成抗乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）的小分子抗体Fab阻断肝移植后乙肝病毒再感染的作用效应。方法:通过体外抗原黏附实验，补体毒实验和病毒感染实验，计算抗原黏附率、细胞死亡率和细胞感染率,进行统计分析，研究抗体Fab的功能效应。结果:在有、无重组抗体存在时，组间的抗原黏附率、细胞死亡率及细胞感染率对比，差异均有显著性（均为P<0.05）,实验数据在统计学上有显著差异。结论:重组合成抗体Fab能阻断抗原对靶细胞的黏附，能介导补体毒杀伤靶细胞，降低HBV对人原代肝细胞的感染率。基因重组的小分子抗体Fab的体外效应实验为其在体内临床应用打下基础。     

rAAV-Fab转染小鼠骨骼肌体内表达分析

目的 乙肝表面抗体是一种保护性抗体,利用基因重组法构建含乙肝表面抗原抗体Fab基因的重组腺相关病毒(rAAV-Fab),通过转染小鼠腿部骨骼肌,观察此种转染途径,Fab的表达情况.方法 肌肉注射1011、5×1010、5×1093种滴度的rAAV-Fab,感染小鼠腿部肌肉组织,用荧光免疫吸附法检测血清中Fab含量变化.免疫组化分析表达分布.病理组织学检测转染后组织损伤.结果 小鼠肌注rAAV-Fab后,2个月内在血清中均有持续较高表达Fab,其后呈现较低趋势,直至第4个月观察结束.转染后,全身多个脏器组织切片均可检测到阳性信号,但3种病毒滴度转染比较,肝脏转染并无差异.主要脏器病理检查结果为阴性.结论 骨骼肌转染rAAV-Fab能够有效介导Fab基因在小鼠体内表达,转染广泛,且此方法安全有效,为进一步实验研究提供了依据.