一种筛选原核高效表达克隆的方法

外源基因在大肠杆菌中的低表达往往与基因５’端核苷酸序列不利于翻译起始有关。未经修饰的ＧＭ－ＣＳＦ在大肠杆菌中表达量很低，我们选用ＧＭ－ＣＳＦ作为报道基因，在不改变氨基酸序列的前提下，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增，构建了两类包含５’端１０个密码子的简并序列库，为便于快速筛选高表达的克隆，构建了四环素抗性（ＴｅｔＲ）选择载体筛选系统，其基本原理是外源基因与ＴｅｔＲ基因串联，高表达的ＧＭ－ＣＳＦ５’端带动ＴｅｔＲ的表达，逐渐提高四环素浓度就可以筛选出适合高表达的ＧＭ－ＣＳＦ５’端序列。最终在四环素浓度高达６０μｇ／ｍｌ的培养基上筛选了数个高表达克隆。这种系统对大肠杆菌中表达量低、但具有重大经济价值的细胞因子的表达有重要的意义     

四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆

目的：应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法：将四环素抗性基因（Tet^R)克隆到载体p^BV223；根据氨基酸密码子的简并性，在保持原有氨基酸序列不变的情况下，人工合成外源基因的cDA5′端简并引物库，以hGM-CSF克隆文库，导入大肠杆菌DH5α中，构建转基因的细菌文库，在不同质量浓度（20mg/L,40mg/L,50mg/L,60mg/L)的四环素培养基中培养。结果：从高浓度四环素培养基中获得高效表达的p^BV223/hGM-CSF克隆，测序结果显示该克隆的hGM-CSFcDNA5′端序列与天然序列比较有7个碱基发生突变，且符合实验设计的要求，通过基因重组，构建成最终的高效表达克隆P^BV220d/hGM-CSF,其表达hGM-CSF的量占细菌总量的18%，较原表达水平提高80%。结论：可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。     

WT1基因特异性siRNA对K562细胞表达及增殖的影响

目的:研究WT1基因特异性小干扰RNA (small RNA interference, siRNA)对K562细胞表达及增殖的影响,为白血病的基因治疗提供新的思路.方法:以慢性粒细胞白血病细胞系-K562为研究对象,化学合成并转染针对K562细胞WT1基因的siRNA,倒置显微镜观察细胞的生长状态及形态学改变;MTT法检测细胞增殖状态;半定量RT-PCR检测siRNA对WT1基因表达的抑制作用;流式细胞仪法检测K562细胞凋亡.结果:siRNA转染K562细胞后, 细胞生长受抑,增殖能力减弱,其增殖抑制作用于转染后48、72 h最明显, 增殖抑制率分别为50.6%和54.1%.半定量RT-PCR显示WT1mRNA表达水平明显低于对照组;WT1 siRNA转染48 h后有42.19 %的K562细胞发生凋亡.结论:WT1基因特异性siRNA可显著抑制K562细胞增殖,促进凋亡,为白血病的基因治疗提供了新的思路.     

自体外周血CD_(34)~ 造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤

[目的]探讨自体外周血CD 造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤的可行性。[方法]应用CliniMACS系统分选纯化患者外周血CD 造血干细胞 ,用流式细胞仪检测分选纯化结果。选马法兰200mg/m2 作为预处理方案。[结果]分选纯化结果 ,单个核细胞数为3.7136×108,活性率96.6% ,CD 细胞数3.68018×108,即5.52×106/kg。移植后患者骨髓像获得完全缓解。移植相关并发症少且易于控制。[结论]自体外周血CD 造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤是安全、有效、可行的。     

泰索帝联合异环磷酰胺、顺铂治疗晚期非小细胞肺癌

目的 :研究泰索帝联合异环磷酰胺、顺铂治疗晚期非小细胞肺癌 (NSCLC)的临床疗效和不良反应。方法 :第 1天用泰索帝 6 0mg/m2 ,静脉滴注 3h ,应用泰索帝治疗前给予抗过敏治疗 ,第 2～ 4天给予异环磷酰胺 1.2 /m2 ,顺铂 30mg/m2 ,2 1天～ 2 8天为一周期 ,共用 3周期。结果 :完全缓解 (CR) 8.3% ( 1/12 ) ,部分缓解 (PR) 5 8.3% ( 6 /12 ) ,Ⅲ°～Ⅳ°骨髓抑制 2 5 % ( 3/12 )。结论 :泰索帝联合异环磷酰胺、顺铂治疗晚期非小细胞肺癌的有效率高 ,重度骨髓抑制的发生率也较高。     

人类脐带源间充质干细胞细胞因子分泌及造血支持作用的研究

目的研究脐带源间充质干细胞（UC—MSC）细胞因子分泌特征及其对脐血源CD34^＋细胞的造血支持作用,并与骨髓源间充质干细胞（BM—MSC）相对照。方法RT—PCR法检测UC—MSC和BM—MSC细胞因子分泌。将脐血CD34^＋细胞分别接种于UC—MSC或BM—MSC滋养层共培养5周,收集贴壁与非贴壁细胞接种于标准甲基纤维素培养基,计数克隆形成细胞（CFC）。结果UC—MSC表达SCF、LIF、M—CSF、Flt-3、IL-6、GM—CSF、G—CSF、SDF-1和VEGFmRNA,不表达IL-3mRNA。与BM—MSC相比,二者表达细胞因子谱相似,但BM—MSC不表达GM—CSF和G—CSFmRNA。共培养5周计数CFC显示,BFU—E、GFU—GM和CFU—GEMM在CD刍细胞／UC—MSC（75．5±27．9,100．0±25．1,9．5±7．3）与CD34^＋细胞／BM—MSC（70．5±28．8,108．3±9．5,8．5±5.1）共培养体系差异无统计学意义（P〉0．05）。结论UC—MSC与BM—MSC具有相似的造血支持功能和细胞因子分泌谱。     

来那度胺在慢性淋巴细胞白血病中应用的研究进展

近年来,慢性淋巴细胞白血病发病率越来越高,微环境和免疫系统异常在其发病机制中起重要作用。常规化疗方案如FCR会加重免疫系统功能缺陷,导致患者感染率增加,造成不良预后。来那度胺的出现改变了这种状况。近年来的研究表明,来那度胺单药应用治疗难治复发CLL患者总有效率（ORR）大概32％-47％,完全缓解（CR）大概7％-13％;来那度胺与美罗华联用治疗复发难治CLL患者ORR大概53％-66％,CR大概12％-3％;且与其他药物如ofatumumab联合时,均显著提高了复发难治CLL患者的疗效且大大减少了不良反应,其不良反应主要为中性粒细胞减少症、血小板减少症、贫血、溶瘤综合征（tumorlysissyndrome,TLS）、燃瘤反应（TFR）和静脉血栓栓塞（VTE）。本文就近几年来那度胺在CLL中的应用进展做-综述。     

9例原发性结外淋巴瘤误诊分析

原发于淋巴结以外组织的淋巴瘤称为结外淋巴瘤 ,其发生部位多见于扁桃体、鼻咽部及胃肠道 ,其他部位较少见。我院 1998年 12月至 2 0 0 0年 12月共收治 9例原发结外淋巴瘤 ,其中 4例为胃黏膜相关淋巴瘤 ,3例为乳腺淋巴瘤 ,2例为甲状腺淋巴瘤 ,术前误诊 5例 ,误诊率约为 5 5 %。     

局部麻醉下骨髓采集术的安全性观察

目的　为恶性血液病及实体瘤大剂量化疗联合造血干细胞移植探讨一种方便、有效、安全的采集骨髓方法。方法　2 3例采集术于采集前3 0min肌注杜冷丁5 0mg、安定10mg ,半小时后,用0 .1%利多卡因2 0 0～40 0mg多部位局麻,采集骨髓2 0 0～80 0mL。采集过程中回输异体压积红细胞或自体血,同时观察疼痛情况、监测生命体征。结果　全部病例生命体征稳定。术中疼痛的VAS评分(视觉模拟评分法) 1分2人(8% ) ,2分19人(84% ) ,3分2人(4 % )。术后第2天患者即可自由活动,无麻醉相关不良反应。结论　局麻下采集骨髓简便、安全,值得推广使用。     

毛萼乙素抑制非霍奇金淋巴瘤细胞增殖作用及其机制探讨

目的 毛萼乙素(EriocalyxinB,EriB)是一种从唇形科植物疏花毛萼香茶菜中提取的二萜类化合物,具有很强的抗肿瘤细胞活性.本研究探讨EriB对非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma,NHL)细胞增殖抑制及凋亡诱导、周期阻滞作用及机制.方法 采用MTT法检测5个浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1μmol/L) EriB处理72 h淋巴瘤细胞株的增殖抑制作用;流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期变化;蛋白质印迹法分析不同信号通路蛋白的表达.结果 0、0.2、0.4、0.6、0.8和1μmol/L浓度的EriB对淋巴瘤细胞均有增殖抑制作用,且抑制作用随着浓度增加而增强,半数生长抑制浓度在0.2～1.0μmol/L.流式细胞术检测显示,0.4μmol/L EriB作用Namalwa细胞24 h后G0/G1期细胞百分率为(44.71±4.10)％,对照组为(33.79±1.86)％,差异有统计学意义,Z=17.78,P=0.041;FCM结果显示,分析0.4μmol/L EriB作用Namalwa细胞6、12和24 h凋亡率分别为(4.21±1.06)％、(20.34±4.71)％和(29.91±5.39)％,显著高于对照组的(3.04±0.96)％,差异有统计学意义,H=8.56,P＜0.001.蛋白质印迹法分析显示,EriB处理后的Namalwa细胞蛋白p21、p27、p-Caspase-3、p-Caspase-8和p-Caspase-9表达上调,磷酸化NF-κB和其激活子IκB激酶表达下调.结论 EriB可能通过下调NF-κB信号通路诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制淋巴瘤细胞增殖.