激肽释放酶腺相关病毒载体的构建及对脐静脉内皮细胞功能的影响

目的构建激肽释放酶(HK)腺相关病毒(AAV)载体,检测重组病毒感染脐静脉内皮细胞系(HUVEC)后HK基因和内皮功能相关基因表达的变化。方法HK基因克隆人腺相关病毒载体质粒pAAV-MCS,和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、腺病毒辅助质粒pHe1per共转染293细胞,包装成带有HK基因的重组腺相关病毒(rAAV-HK)。以rAAV-HK感染HUVEC。RT-PCR法检测HK基因、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、凋亡蛋白酶(caspase-3)、内皮素-1(ET-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素B_1受体以及缓激肽B_1受体、缓激肽B_2受体的mRNA转录变化。ELISA法测定HUVEC上清液和胞内HK的含量。结果成功构建了rAAV-HK。rAAV-HK感染HUVEC后,实验组胞内HKmRNA转录(0．59±0．12)比空白组(0．26±0．05)明显增加(P＜0．01)；实验组胞内HK含量(120．1±40．9)比空白组(30．8±12．8)显著升高(P＜0．01)；实验组eNOSmRNA转录(1．19±0．28)较空白组(0．66±0．11)增加(P＜0．05),实验组caspase-3mRNA转录(0．30±0．25)较空白组(0．67±0．27)减弱(P＜0．05)。VEGF、内皮素-1、内皮素B_1受体、缓激肽B_1受体、缓激肽B_2受体mRNA转录两组差异无统计学意义。结论rAAV-HK病毒感染HUVEC后能高效表达HK,并促进HUVEC胞内eNOSmRNA转录,抑制caspase-3mRNA转录,提示导入HK基因能够改善内皮功能。     

深圳地方株人乳头瘤病毒18型E6E7基因的克隆、序列分析及E6/E7融合基因的构建

[摘要] 目的 克隆人乳头瘤病毒18型E6E7基因序列,构建E6/E7融合基因,为HPV治疗性疫苗的研制打下基础。方法 采用PCR 技术扩增1例HPV18阳性患者组织中HPV18 E6E7基因。将PCR产物回收,插入pSC-A质粒载体构建pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析;通过点突变方法使HPV18 E6、E7基因的开放读码框(ORF)融合以简化后续的基因表达问题。结果 成功构建了pSC-A/HPV18E6E7重组质粒,测序分析表明克隆的HPV18 E6E7基因与GenBank收录的德国株(AY262282)完全一致,点突变成功使E6基因的终止密码子突变,使HPV18 E6、E7基因融合。结论 本研究获得了正确的HPV18 E6E7基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。     

卵巢上皮性癌切除修复交叉互补基因1变异的确认及其功能研究

核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）是通过切除药物或者紫外线等对DNA损伤形成的DNA加合物,从而维护基因组的完整性.在人类细胞中,化学药物以及紫外线造成的DNA损伤主要通过NER途径修复,而切除修复交叉互补基因1（ERCC1）在NER途径中起着关键作用.     

华法林抗凝治疗患者CYP2C9基因多态性的研究

[目的]研究深圳地区口服华法林抗凝治疗患者细胞色素P4502C9(CYP2C9)基因CYP2C9*1、 CYP2C9*2、 CYP2C9*3多态性的特点.[方法]应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测151例口服华法林抗凝治疗患者CYP2C9基因CYP2C9*1、 CYP2C9*2、 CYP2C9*3的多态性.[结果]151例口服华法林抗凝治疗患者中未检测出CYP2C9*2等位基因,CYP2C9*1、 CYP2C9*3等位基因的频率分别为92.7%和7.3%, CYP2C9*1*1、 CYP2C9*1*3、 CYP2C9*3*3基因型频率分别为85.4%(129)、14.6%(22)、0(0).[结论]深圳地区口服华法林抗凝治疗病人中存在CYP2C9*3突变基因,使用华法林抗凝治疗时应检测患者CYP2C9的基因型.     

人激肽释放酶腺相关病毒载体的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的研究人激肽释放酶腺相关病毒载体的构建,观察重组病毒感染人脐静脉内皮细胞株后人激肽释放酶基因的表达。方法将人激肽释放酶基因定向克隆入AAV载体质粒pAAV-MCS中,并与两种辅助质粒pAAV-RC和pHelper共转染293细胞,包装成带有人激肽释放酶基因的重组腺相关病毒(rAAV);收集病毒颗粒并测定病毒滴度。以不同滴度的病毒分别感染人脐静脉内皮细胞,逆转录聚合酶链反应定量检测人激肽释放酶在该细胞中的表达。酶联免疫吸附法测定人脐静脉内皮细胞内人激肽释放酶的含量。结果成功获得了重组人激肽释放酶基因AAV载体,重组病毒滴度为6.2×1010个/L。以滴度分别为1×109个/L、1×108个/L和1×107个/L的病毒感染人脐静脉内皮细胞,与空白对照组比较,人激肽释放酶的表达均有增加(P<0.05),但以1×109个/L组升高最明显(P<0.001)。结论带有人激肽释放酶的重组腺相关病毒滴度可以稳定地达到1010个/L以上,感染人脐静脉内皮细胞后,人激肽释放酶基因在宿主细胞中的表达明显增强。     

单细胞凝胶电泳评价顺铂致人卵巢癌细胞DNA损伤修复的实验研究

目的：采用单细胞凝胶电泳(彗星实验)研究顺铂致人类卵巢癌H08910细胞DNA的损伤及修复，为彗星实验应用于临床检测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性奠定基础。方法细胞采用0．02 EC50、0．03 ECS0及O．05 EC50三种浓度顺铂处理1h，更换培养基后，继续培养3h、24h和48h进行彗星电泳实验。结果：顺铂处理后造成H08910细胞产生明显的DNA损伤，呈现不同彗尾长度的彗星。顺铂浓度增加，平均彗尾长度增加；一定顺铂浓度下，彗尾长度随培养时间的延长逐渐减小，较低浓度(0．02 EC50)处理的细胞在培养48h后彗尾长度可恢复至接近对照组的水平；在顺铂处理0．02 EC50浓度下随培养时间延长，彗星出现比率逐渐下降，而0．05 EC50浓度处理的细胞彗星比率则呈上升趋势。结论彗星实验检测DNA损伤及修复的敏感度较高，H08910细胞可修复一定浓度的顺铂引起的DNA损伤。