心脏缺血预处理及其应用研究现状

1986年Muny等发现当反复短暂的缺血和再灌注之后心脏对缺血状态产生适应,这种适应可以使心肌在后续的持续性缺血中得到保护,保护效应有能量消耗的降低和在缺血过程中细胞损伤状况的延迟,由此他们提出了“缺血预处理”这一概念,此概念的提出纠正了多年来人们一直认为反复短暂心肌缺血会造成累积性损伤,最终导致心肌梗塞的观点,从此缺血心肌的保护及其机理探讨开始了崭新的一页。     

马桑内酯对大鼠海马锥体神经元钙激活钾通道的影响

目的　了解致痫剂马桑内酯 (CL)对培养的大鼠海马锥体神经元细胞膜钙激活钾通道 (KCa)的调节作用及癫痫的发病机理。方法　采用膜片钳单通道电流记录技术进行定量研究。结果　 1在内面向外式膜片下 ,KCa(12 0 .34± 2 5 .12 ) p S表现出钙离子浓度依赖性 (n=6 )、电压依赖性 (n=17)和四乙基胺 (TEA)阻断特点 ;2在细胞贴附式膜片下 ,浴液中加入 CL 可明显激活 KCa(P<0 .0 1) ;3在对称性高钾溶液中 ,使浴液 [Ca2 + ]i 为 10 - 8m ol/L,维持神经元膜电位为 2 0 m V,当 CL 为 0 μl/ m l和 1.0 μl/ m l时 ,可分别使 KCa开放概率从 0 .0 2 5增加到 0 .5 5 3(P<0 .0 1) ,通道活动的平均开放时间 (ms)从 1.875± 0 .4 12增加到 6 .82 9± 0 .136 ,平均关闭时间 (m s)从 179.342±13.831降低到 6 .4 12± 1.383(n=2 5 ,P<0 .0 1)。结论　在 CL 诱导的癫痫发病中 ,钙激活钾通道活化可能起重要的负反馈调节作用。     

槲皮素对人肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的激活作用

目的:观察槲皮素对人肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道(KCa)的影响,以探讨槲皮素在分子水平扩张血管的作用机制.方法:选取需择期行腹部手术并且血压正常的患者14例,取肠系膜动脉小分支,用急性酶消化法获得单个肠系膜动脉平滑肌细胞.然后应用单通道细胞膜片钳技术观察不同浓度槲皮素对肠系膜动脉平滑肌细胞KCa通道开放概率(NPo)、电流幅度值(Am)、平均开放时间(To)、平均关闭时间(Tc)等各指标的影响.结果:在内面向外式方式下,随着浴液中槲皮素浓度的增高,通道NPo明显增高:槲皮素浓度100μmol/L时,NPo由用药前(即0 μmol/L)的0.028 62±0.011 99增高到0.147 03±0.058 17(P＜0.01);通道Am、To变化不大(P＞0.05);而通道Tc明显缩短:由用药前(477.650±376.650)ms缩短到(112.643±114.365)ms(P＜0.01).结论:槲皮素能直接激活人类血管平滑肌细胞KCa通道而实现降血压效应.     

人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa通道在HEK293细胞上的表达方法研究

目的:本研究旨在HEK 293细胞系上成功表达人肠系膜血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channels,BKCa),建立一种稳定高效表达人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa的HEK 293细胞系方法,进一步揭示在工具细胞表达上的BKCa的基本特性,为以后的诸多实验提供参考价值.方法:应用基因工程技术构建人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa通道基因表达载体,用脂质体转染法转染HEK 293细胞,建立了稳定高效表达BKCa通道的HEK 293细胞系的方法.结果:在HEK 293细胞系上表达的BKCa单通道电流的电导值为229.56±4.62 pS,具有电压依赖性,钙离子敏感性等特性;在HEK 293细胞系表达的BKCa全细胞宏观电流具有明显的电压依赖性和外向整流特性.结论:成功建立了一种在HEK293细胞系上表达的BKCa通道的实验方法,并成功记录到BKCa通道的单通道电流和全细胞宏观电流,且与天然细胞上BKCa通道电流特性基本一致.     

表达在HEK293细胞上的BKCa通道基本特性与动力学调控研究

目的构建稳定表达人血管平滑肌大电导钙激活钾通道(BKCa)的293细胞系,并研究其基本电生理学特征和动力学模型。方法通过脂质体(lipofectamine 2000)转染法转染BKCa表达质粒pcDNA3.1-BKα和(或)pIRES-BKβ1,筛选稳定表达的单克隆细胞系。使用膜片钳多种记录方式研究其基本电生理学特性,同时建立BKCa动力学研究模型。结果构建稳定转染BKCa通道α和(或)β1亚单位的HEK293细胞系,通过膜片钳能够记录到具有与天然细胞BKCa电生理学特性相似的电流,包括大电导特性[内面向外式构型下单通道电导为(216.38±3.55)pS]、电压依赖性、Ca2+依赖性、钾离子选择性和200nmol/L IbTX(BKCa特异性阻断剂)阻断;联合表达β1亚单位能够明显增加通道的开放时程。采用inside-out宏观电流记录方式可以记录到明显的尾电流。可以用于分析通道激活、去激活等动力学模型及药物动力学作用机制。结论成功构建稳定转染BKCa通道α和(或)β1亚单位的HEK293细胞系。膜片钳实验证明具有典型的BKCa电生理学特性,同时建立的细胞系可以很好的用于BKCa通道功能调控研究和动力学参数分析。     

心肌单相动作电位不同引导途径的探讨和评价

本文对应用接触电极引导心外膜MAP的一些可能途径进行了探讨和客观评价。实验结果表明,心外膜上直接引导MAP优于开胸后心包膜上间接引导MAP及经胸穿刺心包膜上间接引导MAP的途径,其记录稳定,结果可靠,可进行多项工作,有利于机制的阐明。     

慢性心房颤动降低Junctophilin-2在心房中的表达研究

目的 明确在慢性心房颤动(AF)中Junctophilin-2 (JPH2)表达变化及意义.方法 从心脏外科体外循环手术中获取21例窦性心律(SR)患者和30例慢性AF患者右心房肌组织,采用免疫组织化学方法测定心房肌组织JPH2蛋白的分布;实时荧光定量PCR法检测心房肌JPH2 mRNA水平;Western blot测定人心房肌JPH2蛋白水平.结果 免疫组织化学实验发现SR组与AF组心房肌组织上均存在JPH2蛋白表达,SR组着色更明显;AF组心房肌JPH2 mRNA水平和蛋白水平均明显低于SR组(P＜0.01).结论 慢性AF患者心房肌JPH2的表达下调可能与心房肌细胞内钙紊乱密切相关.     

大鼠主动脉平滑肌钙激活钾通道的增龄变化

目的 研究不同月龄大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道(KCa)的增龄变化,以探讨老化过程中血管平滑肌KCa的变化规律.方法 应用膜片钳技术,研究3组大鼠(分别为1月,6月,20月龄,各10只)主动脉平滑肌细胞KCa的增龄变化.结果 在内面向外膜片上,1月龄与6月龄相比,KCa对Ca2 的敏感性差异无显著性.而20月龄KCa对Ca2 的敏感性低于6月龄,20月龄与6月龄相比,在[Ca2 ]free分别为5×10-7,10-6mol/L时,通道开放概率(P0)明显减小;在[Ca2 ]free分别为10-7,5×10-7,10-6mol/L时,通道的关闭时间(Tc)显著延长,P均＜0.05.结论 随着年龄增加,主动脉平滑肌细胞KCa通道的活性下降,KCa的失活机制可能发生改变.     

重组蛋白酶切方法的比较与分析

目的探讨制备纯化重组蛋白的酶切方法,比较不同蛋白纯化方法的差异。方法在大肠杆菌BL-21中分别诱导表达p GEX-6p-3/CT1,p GEX-6p-3/CT3,p GEX-6p-3/Ca M,p GEX-6p-3/Ca MKⅡ。采用超声破碎、B-per试剂以及B-per试剂加变性复性试剂盒等方法制备带GST标签的融合蛋白,进一步在不同条件下使用蛋白酶进行酶切获得相应蛋白。将制备得到的蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定,同时,使用pull-down方法对蛋白活性进行鉴定。结果采用B-per试剂以及变性再复性试剂盒,同时酶切时加入DTT,能得到较高浓度与纯度的CT1蛋白。而无论采用B-per试剂或超声破碎,只要酶切时加入DTT均能获得CT3蛋白。采用简单的超声破碎,酶切时不需加入任何试剂即可得到高浓度与高纯度的胞浆蛋白Ca M,而目前仍没找到纯化Ca MKⅡ蛋白的理想方法,需进一步的实验研究。结论重组蛋白酶切纯化方法存在差异,DTT可能在酶切纯化蛋白时起到关键作用。     

高频心电图及高速扩大心电图对冠心病诊断价值的评价

应用高频心电图（ＨＦＥｃＧ）和高速扩大心电图（ＨｓＭＥＣＧ）技术，对２３４例冠心病患者和２２２例正常人进行了对比研究。结果：ＨＦＥＣＧ六导切迹数正常值范围上限为３个，频率正常值范围上限为、７８．５Ｈｚ，ＨｓＭＥｃＧ的ＰｔｆＶ１正常值范围下限为－０．０２５８ｍｍ·ｓ；冠心病组的六导切迹数为５．１７±１．９９个，最高频率为１１４．６±６７．４Ｈｚ。ＰｔｆＶ１为－０．０３７±０．０１７ｍｍ·ｓ，均明显高于正常人（ｐ＜０．００１）；③对冠心病的诊断，若以六导切迹数＞４个为标准则敏感性、特异性、正确性分别为８１．９％、９８．２％、９１．２％，若以最高频率＞８０Ｈｚ为标准则敏感性、特异性、正确性分别为６６．３％、９４．６％、８２．４％，若以ＰｔｆＶ１＜－０．０２６ｍｍ·８为标准则敏感性、特异性、正确性分别为６９．５％、９５．５％、８０．１％；④不同ＥＣＧ检测技术对冠心病诊断的敏感性排序为ＨＦＥＣＧ切迹计数法＞ＨＦＥＣＧ频谱分析法＞ＨＳＭＥＣＧ的ＰｔｆＶ１法＞常规ＥＣＧ的ＰｔｆＶ１法。结果提示，ＨＦＥＣＧ和ＨｓＭＥＣＧ是诊断冠心病敏感性、特异性高的无创伤性检测技术。