再生柞蚕丝素蛋白对人骨髓间充质干细胞体外扩增的支持作用

大量的研究表明家蚕丝素蛋白具有良好的生物相容性。而对于柞蚕丝素蛋白在医用生物领域的研究报道在国内外尚较少。本研究选择再生柞蚕丝素蛋白为研究对象，观察了人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）在再生柞蚕丝素膜上的粘附、生长及表面抗原的变化。结果在1h观察再生柞蚕丝素对hBMSCs的粘附力几乎与胶原相同，明显优于家蚕丝素和聚苯乙烯培养板。MTT法检测结果显示在第4d hBMSCs在再生柞蚕丝素膜上的增殖明显高于其他各组。电镜观察结果显示hBMSCs在再生柞蚕丝素膜上能够很好的粘附、生长，细胞间能相互连接形成片状结构。流式细胞仪检测再生柞蚕丝素蛋白对hBMSCs表面抗原的表达亦无明显影响。本研究结果显示再生柞蚕丝素蛋白体外支持hBMSCs的粘附、生长，具有良好的细胞相容性。     

再生障碍性贫血患者淋巴细胞表型变化

目的：研究再生障碍性贫血（AA）患者骨髓（BM）及外周血（PB）淋巴细胞及其活化相关分子的表达及临床意义。方法：采用单色和双色免疫荧光标记法，流式细胞仪分析AA患者的BM和PB中淋巴细胞膜分子的表达。结果：AA患者BM和BP中CD8^ 细胞增加，CD4／CD8比例下降，BM在CD25^ 细胞和HLA－DR^ 细胞增多，急性AA增加尤为显著（P＜0．01），BM中CD16^ 或CD56^ 细胞也明显增多（P＜0．05），双标记分析提示T细胞主要为CD8^ 细胞：急性AA患者CD8^ -CD25^ 细胞显著增多（P＜0．01），AA患者BM中淋巴细胞活化相关分子表达增多，尤其4－1BB^ ,CD95L^ 和CD40L＋细胞显著增多（P＜0．01），结论：AA患者BM中淋巴细胞活化相关膜分子增多，是AA免疫功能异常及最终导致造血功能衰竭的原因之一。     

鼠抗人OX40功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的：研制功能性鼠抗人OX40单克隆抗体。方法：以转人OX40的转基因细胞L929-OX40为免疫原，常规免疫6—8周龄的雌性BALB／c小鼠；采用B淋巴细胞融合技术，将免疫小鼠脾脏细胞与SP2／0融合，以L929-OX40转基因细胞及PHA活化的T细胞为抗体筛选阳性细胞，经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养；采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该单抗的亚类及抗原识别位点；采用MTT法分析单抗在体外对T细胞的促增殖效应以及ELISA分析活化T细胞分泌的细胞因子。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7E11)，该单抗能特异性地识别人OX40分子和介导有效的共刺激信号，体外促进活化的T细胞增殖和细胞因子的分泌。结论：成功研制成一株能分泌功能性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤，该抗体特异性地识别人OX40分子并具有在体外协同刺激T细胞的作用。     

一株新的鼠抗人2IgB7-H3功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

研制功能性鼠抗人2IgB7-H3单克隆抗体。以人2IgB7-H3基因转染细胞L929/2IgB7-H3为免疫原,常规免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠;利用B淋巴杂交瘤技术,将免疫小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞株SP2/0融合,L929/2IgB7-H3细胞为抗原筛选阳性细胞;经间接免疫荧光标记法对杂交瘤细胞进行反复筛选和多次克隆化培养;采用快速定性试纸法鉴定单抗Ig亚类;利用竞争抑制性实验分析该单抗识别的抗原表位;采用MTT法分析该单抗在体外阻断DC对T细胞的促增殖效应。结果:获得了1株持续稳定分泌鼠抗人2IgB7-H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7D7),该单抗可特异识别L929/2IgB7-H3分子和介导有效的共刺激信号。该单抗的成功获得和其生物学特性的初步鉴定,为进一步研究B7-H3两个异构体在DC细胞及肿瘤细胞上的作用机制奠定了物质基础。     

125I标记抗人CD40 mAb 5H6在荷人卵巢癌(HO8910)BALB/c裸鼠体内分布及放射免疫显像

目的研究125I标记抗人CD40单克隆抗体(mAb)5H6同卵巢癌细胞HO8910体外结合的生物学特性以及在荷瘤鼠体内的分布和放射免疫显像.方法氯胺-T法进行mAb 5H6125I标记(125I-5H6),Lindmo法计算125I-5H6的免疫活性分数;细胞结合饱和实验进行Scatchard分析计算解离常数Kd及最大结合位点数Bmax;建立荷人卵巢癌(HO8910)裸鼠模型,分析125I-5H6在体内的分布,并用SPECT进行放射免疫显像.结果mAb 5H6标记率为(85.4±5.2)%,放射化学纯度为(99.2±0.5)%,125I-5H6免疫活性分数为(38.6±5.4)%,与HO8910细胞的亲和力Kd=(0.711±0.06)nmol/L.在荷瘤鼠体内特异性结合HO8910肿瘤,48小时达到高峰,放射免疫显像肿瘤清晰可见.结论125I-5H6同卵巢癌HO8910细胞在体外结合具有很高亲和力,在体内能特异性结合HO8910肿瘤,能获得优质的放射免疫图像.     

人骨髓MSC对PHA活化T细胞周期以及表型和细胞因子分泌的影响

目的研究人骨髓间充质干细胞(MSC)对T细胞周期和活化的影响,探讨MSC对T细胞增殖抑制的作用机制。方法Ficoll密度梯度离心法分离纯化人骨髓MSC,体外扩增培养3代后用于实验。应用流式细胞术分析MSC对PHA作用下T细胞周期和早期表型CD25、CD69表达的影响,ELISA法检测细胞因子水平。结果人骨髓MSC体外可使PHA刺激下的T细胞滞留于细胞周期的G0/G1期,下调活化T细胞早期表型CD25、CD69的表达,抑制IL-2、IFN-r的分泌。结论人骨髓MSC体外可通过对T细胞周期的影响抑制其活化和增殖。     

Graves病患者外周血IL-6、TNF-α水平表达的变化及意义

目的：探讨IL-6、TNF-α与Graves病（GD）发病之间的联系及其意义。方法：采用ELISA法测定83例GD患者治疗前后外周血IL-6、TNF-α水平变化，并与，13、T4、HT3、FT4、TSH作多元相关性分析。结果：（1）GD患者IL-6、TNF-α水平显著高于正常人（P〈0．0001），且两者间呈正相关（P〈0．001）。（2）IL-6、TNF-α与，13、T4、HT3、FT4均呈正相关（P〈0．001），而与TSH呈负相关（P〈0．001）。（3）经治疗后IL-6、TNF-α．水平明显下降（P〈0．001），但仍高于对照组（P〈0．01）。结论：推测IL-6、TNF异常升高可能与GD免疫学发病机制有关，经治疗后IL-6、TNF-α水平明显下降，提示抗甲状腺药物可能具有一定的免疫调节作用。     

凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞对抗原特异性CTL的激活

为探讨凋亡Daudi细胞负载的树突状细胞 (DC )激发诱导肿瘤抗原特异性CTL及其生物学特性 ,采用常规方法从人外周血单个核细胞 (PBMC )诱导DC ,激发型CD40mAb联合 50Gyγ射线辐照诱导Daudi凋亡后负载DC ,然后与自体T细胞共育 ,并联合IL 2激发诱导肿瘤特异性CTL ;采用免疫荧光标记和流式细胞仪测定分析膜分子的表达 ;ELISA检测细胞因子的产生 ;Dextran FITC内吞实验分析DC的抗原摄取能力 ;3H掺入试验和51 Cr释放试验分别测定CTL的增殖和细胞毒效应。结果 :(1 )细胞因子序贯体外诱导 7d的DC ,对Dextran吞噬能力最强 ;(2 )CD40mAb诱导联合γ射线辐照 ,能有效介导Daudi细胞的凋亡 ;(3 )抗原负载联合CD40mAb激发可使DC上调表达CD1a、CD80、CD86和HLA DR ,并能促进IL 1 2的分泌 ;(4)凋亡Daudi负载后的DC在激发型CD40mAb作用下 ,能激发和扩增对Daudi细胞具有高效和特异杀伤作用的细胞毒性T细胞。因而认为凋亡肿瘤细胞负载联合CD40mAb刺激的DC可有效激活和扩增肿瘤特异性CTL。     

一株抗人BLys单克隆抗体的制备及其生物学功能研究

研究以稳定高表达BLys的基因转染细胞L-BLys为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,L-BLys细胞和天然表达BLys的HL60细胞为抗体筛选阳性细胞株,经免疫荧光标记分析反复筛选和以有限稀释法反复克隆化培养。将获得的克隆4F7培养细胞注射入经致敏的小鼠体内,-抽取的腹水经Protein G亲和层析柱纯化。将纯化所得的抗体作用于经BLys分子刺激的扁桃体B细胞,3H-TdR检测细胞的增殖效率。结果获得1株持续、稳定分泌鼠抗人BLys单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该细胞株所分泌的抗体能阻断膜型和可溶性BLys分子对扁桃体B细胞的促增殖作用。对这株单克隆抗体生物学功能的研究表明,这株单抗能特异性识别人BLys分子及阻断膜型和可溶性BLys发挥生物学活性。     

大肠杆菌表达重组人IL-8分离纯化工艺的建立

目的　建立重组人IL - 8(rhIL - 8)大肠杆菌表达后的高效分离纯化工艺 ,以便获得高纯度的重组蛋白。方法　将已构建好的表达载体转化大肠杆菌HB10 1,经IPTG诱导进行高效表达。将离心收集到的菌体用超声破壁分离 ,收集包涵体和胞浆 ,其中包涵体部分经变性和复性处理后 ,与胞浆部分合并 ,进行肝素亲和层析柱分离 ,再经离子交换柱和凝胶层析柱过滤 ,得到最终纯品。蛋白纯度用SDS -PAGE鉴定 ,ELISA法检测重组IL - 8含量。检测纯化后重组蛋白的生物学活性和热源质。结果　用大肠杆菌HB10 1表达重组人IL - 8,具有较高的表达量 (2 5mg/ml) ,其分泌的重组蛋白以包涵体和胞浆的形式存在。经多步柱层析纯化后 ,可获得高纯度的重组IL- 8蛋白 (纯度 >95 % )。该蛋白在体外具有趋化中性粒细胞游走的作用 ,兔温法检测热源质含量符合要求。结论　大肠杆菌可高效表达rhIL - 8,该工艺流程可从大肠杆菌载体中获得具有生物学活性的高纯度rhIL - 8。