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目的 观察用RNA干扰(RNAi)下调SMMC-7721人肝癌细胞系P53表达后对细胞增殖及P21蛋白表达的影响。方法 设计合成P53基因的短发夹RNA(shRNA),并构建pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA重组质粒。重组质粒转染SMMC-7721细胞,经G418抗性筛选获得阳性克隆。克隆形成实验观察细胞的增殖,RT-PCR法及Western blot法分别检测P53、P21的mRNA及蛋白表达。BALB/c裸鼠皮下注射SMMC-7721细胞,建立移植瘤模型,瘤部位多点注射pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA,观察瘤体积变化和瘤重。结果 P1、P2、P3三条P53 shRNA均可明显降低P53 mRNA水平(P<0.05, P<0.05, P<0.01);干扰P53表达明显升高SMMC-7721细胞克隆形成率(P<0.05),P21 mRNA和蛋白的表达均随着P53的沉默而显著降低(P<0.05)。P53 shRNA明显增加裸鼠移植瘤的体积和重量(P<0.05)。结论 shRNA干扰P53基因可抑制P53和P21蛋白表达,使癌细胞恶性增殖。 相似文献
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目的探讨氯化两面针碱(NC)对体外培养的肝癌SMMC-7721细胞(以下简称肝癌细胞)DNA聚合酶6催化亚基基因P125蛋白的影响。方法取对数生长期的SMMC-7721肝癌细胞分为给药组和对照组,给药组分别予0.15、0.30、0.60mg/L的NC作用10d。采用集落形成试验观察SMMC-7721细胞的增殖抑制作用;Westernblot法检测P125蛋白表达。结果与对照组相比,给药组NC作用后肝癌细胞集落形成数量明显减少(P〈0.05),并呈现剂量依赖性。给药组P125蛋白表达明显降低,呈剂量依赖性。结论NC可明显抑制肝癌细胞增殖,其作用机制之一可能是从蛋白水平抑制P125表达。 相似文献
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氯化两面针碱(Nitidine chloride,NC)是从芸香科植物两面针根部提取的一种天然生物碱,具有很好的抗肿瘤活性,在体外能抑制鼻咽癌,肺癌等细胞的增殖。研究表明NC可导致细胞周期G2/M期阻滞,并诱导细胞凋亡。E2F/RB在细胞周期调控中起重要作用,它们与CyclinD1、CDK4、CyclinE、CDK2构成复杂的反馈调控网路,调节细胞从G1期到S期的过渡,推动了细胞周期的转变。另外,研究表明E2F是重要的转录因子,参与了基因的转录调控。研究肝癌细胞SMMC-7721经两面针碱处理后RB/E2F通路的相关分子水平变化,以及氯化两面针碱在RB/E2F途径抑制肝癌细胞增殖,参与细胞凋亡作用的机制。应用CCK8方法测定NC对SMMC-7721细胞存活率的影响;Annexin-V和碘化丙碇(propidium i-odide,PI)双染法检测细胞凋亡和坏死情况;RT-PCR检测不同剂量NC对E2F、RB mRNA表达影响;WB检测E2F蛋白含量的变化。结果显示NC可抑制肝癌细胞增殖,降低细胞存活率,促进细胞凋亡,明显降低细胞中E2F、RB mRNA和E2F蛋白的表达,并呈浓度依赖性。NC通过作用于E2F/RB调控通路,抑制了E2F/RB的表达,参与了细胞的增殖抑制和诱导了细胞凋亡。 相似文献
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目的 研究氯化两面针碱(nitidine chloride,NC)处理后p53通路的分子水平变化,以说明p53途径在NC抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖中的作用。方法 应用MTT比色法测定NC对SMMC-7721细胞存活率的影响,细胞克隆集落形成实验测定NC对细胞增殖的抑制作用;实时荧光定量PCR检测不同剂量NC对p53、p21mRNA表达的影响;酶联免疫吸附法测定p53、p21蛋白含量的变化。结果 NC (0.15,0.30,0.60,1.20,2.40,4.80 mg·L-1)浓度依赖性地降低SMMC-7721的存活率,作用48 h时IC50值为(1.03±0.18)mg·L-1;NC可明显抑制细胞集落形成,剂量为0.15,0.30 ng·L-1时,抑制率分别是74.65%、88.48%,剂量为0.60 mg·L-1时,抑制率达到了100%; NC可明显提高癌细胞中p53、p21 mRNA和蛋白的表达,并呈浓度依赖性。结论 p53通路可能在NC诱导的SMMC-7721细胞增殖抑制中起重要作用。 相似文献
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目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行P C R扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-C1质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析;转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-C1组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化;实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLD1及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的C D K4蛋白;S M M C-7721细胞中突变型的C D K4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变;与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08vs0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P<0.05);实验组CDK4mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11vs1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P<0.01),POLD1mRNA相应地升高(2.47±0.25vs1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P<0.01);稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03vs0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P<0.05),P125(0.54±0.04vs0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P<0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关. 相似文献