大量制备过继免疫治疗用γδT细胞时培养基的选择

目的选择适于过继免疫治疗用γδT细胞大量制备的培养基。方法采用不同培养基(RPMI-1640、AIM-V和OpTmizer,分别添加或者不添加自体血清)对γδT细胞进行培养,比较细胞存活率、纯度、扩增效率和生物学功能。结果仅未添加血清的RPMI-1640培养基扩增的细胞存活率随培养时间增加略有下降。不论添加血清与否,AIM-V和OpTmizer培养基扩增的细胞纯度都始终高于RPMI-1640。第2周时,未添加血清的OpTmizer培养基扩增的细胞纯度和扩增效率都显著高于RPMI-1640培养基和AIM-V培养基(P均<0.05)。不同培养基扩增细胞表达的CD107a和分泌的肿瘤坏死因子-α差异均没有统计学意义(P均>0.05),但RPMI-1640培养的细胞对Daudi细胞的杀伤效率显著低于OpT-mizer和AIM-V培养的细胞(P均<0.05)。结论 OpTmizer培养基因其低血清依赖性、高扩增效率和扩增细胞良好的生物学功能,更适用于临床过继免疫治疗用γδT细胞的大量培养。     

氧化应激可选择性诱导细胞的NKG2D配体的表达

目的 探讨氧化应激与细胞NKG2D配体表达的关系,分析氧化应激对NK细胞功能的影响。方法 加H2O2诱导培养的肿瘤细胞处于氧化应激状态。用RT-PCR、Real-time PCR和流式细胞仪等方法分析细胞多种NKG2D配体的表达。用CCK-8法检测NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果 氧化应激可诱导肿瘤细胞多种NKG2D配体的表达,不同的肿瘤细胞诱导表达的NKG2D配体不同;NKG2D配体表达上调可有效提高NK细胞的细胞毒活性,此效应可被抗NKG2D抗体所阻断。结论 NKG2D配体可能在机体的免疫应答中发挥正向的调节作用。     

炎症反应中组织损伤机制的探讨:中性粒细胞化学发光和脱颗粒的研究

以大鼠脱精氨酸C5a(r-C5ai)、人工合成趋化因子N-甲酰-甲硫氨酰一亮氨酰-苯丙氨酸(fMet-Leu-phe,简称FMLP),血清调理的酵母多糖(serum treated zymosan,简称STZ)、热聚IgG(A-IgG)、钙离子载体A23187为刺激物,观察它们对中性粒细胞(PMN)化学发光和脱颗粒的影响,以便为以炎症反应为特征的疾病的发病学研究提供线索。结果表明,所用刺激物均显著提高PMN的化学发光,但不同刺激物对PMN脱颗粒时不同酶的释放影响不同。     

炎症反应中组织损伤机制的探讨：中性粒细胞...

A significant increase of polymorphonuclear leukocytes (PMN) chemiluminescence (CL) was observed when PMN was treated with rat C5ades Arg (r-C5ai), FMLP, opsozined zymosan (STZ) or a calcium ionophore A23487 separately. These stimuli, as well as aggregated IgG (A-IgG), could also cause the release of beta-glucuronidase (beta-g) and myeloperoxidase (MPO) from PMN, on the other hand, elastase (NE) release was not noticed when PMN was treated with r-C5ai and FMLP, which generally stimulated PMN in a cytochalasin B-dependent manner. These results suggest that the kinetics of PMN CL and degranulation vary depending upon the stimulus.     

B细胞活化基因的研究：I.人活化B细胞cDNA文库的构建

本文报导以人活化Ｂ淋巴细胞的３Ｄ５细胞的ｍＲＮＡ为模板，逆转录合成ｃＤＮＡ的第一链；按常规的自身引物法，以合成的第一链为模板合成ｃＤＮＡ第、二链；以λｇｔ１１ Ｓｆｉ－Ｎｏｔ噬菌体为载体，定向插入构建了人活化Ｂ细胞ｃＤＮＡ表达文库。该文库的大小为２．５×１０＾６ｐｆｕ，插入片段长度大于１ｋｂ；用抗ＣＤ７１及ＣＤ９８单克隆抗体为探针，对所构建的文库进行筛选，均获得了阳性克隆。ＣＤ７１及ＣＤ９８均为人     

胸腺肽类因子的研究——Ⅲ.猪胸腺肽的分离纯化、生化性质及其在体外增高E玫瑰花结活性的比较

从新鲜的猪胸腺中分离的小分子肽类提取物,与小牛胸腺制剂相似,在体外具有增高E 玫瑰花结的活性。经 Sephadex G-15和 DEAE-Sephadex A-25纯化,其比生物活性可增高一百多倍。猪胸腺肽 OD_(215)/OD_(260)比值的测定及其加酸水解后生物活性丢失等结果,均证明小分子多肽组份是猪胸腺肽制剂中的活性成份。     

ULBP4原核表达、生物学功能鉴定及其单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:在大肠杆菌中表达ULBP4重组蛋白,并制备其特异性的单克隆抗体(mAb),为γδT细胞对ULBP4的识别机制研究奠定基础。方法:根据GenBank中ULBP4的基因序列设计相应的引物,用RT-PCR方法从HO-8910细胞中扩增得到ULBP4片段,构建重组原核表达质粒pET22b( )/ULBP4(前225aa胞外段),在Rosetta-gamiTMB(DE3)大肠杆菌中获得表达且主要位于包含体中,经纯化透析复性后,分析其对NK细胞IFN-γ细胞因子分泌的影响。以ULBP4为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次经HAT选择培养、间接ELISA法、克隆化培养、荧光免疫检测和流式细胞术以及Western blot筛选和鉴定抗ULBP4 mAb的杂交瘤细胞株。结果:构建了pET22b( )/ULBP4(225aa)原核表达体系,并检测到重组蛋白的有效表达;纯化的重组蛋白在体外培养体系中可以刺激NK细胞IFN-γ细胞因子的分泌。此外,还获得了4株可稳定分泌抗人ULBP4 mAb的杂交瘤细胞株。结论:成功地构建并表达了具有生物活性的ULBP4,为γδT细胞的识别机制研究建立抗原制备平台,同时所制备的抗人ULBP4 mAb,为后续研究奠定了基础。     

T细胞活化的辅助刺激因子:CD28和B7

近年来研究发现,T细胞受体与抗原-主要组织相容性抗原复合物的结合并不能有效地激活T细胞,T细胞的活化尚需要一种辅助刺激因子。T细胞表面的CD28与抗原呈递细胞表面的B7间的作用是T细胞活化最主要的辅助刺激途径。     

利用两种真核昆虫表达系统表达可溶性甲型H1N1血凝素蛋白

目的 利用两种昆虫杆状病毒表达系统表达甲型H1N1血凝素(haemegglutinin,HA)蛋白,进而获得具有牛物学活性的目的 蛋白.方法 选取中国内地第1例2009甲型H1N1确诊病例病毒株A/Sichuan/1/2009(1-11N1),人工合成完整HA基因序列;分别利用杆状病毒表达系统BaculoGold system和Bac-to-Bac system,在昆虫细胞中表达目的 基因HA;经亲和层析纯化及Western blot鉴定,红细胞血凝试验检测HA蛋白的生物学活性.结果 获得测序正确的HA基因,分别克隆到pAcGP67B(BaculoGold system)和pFAST Bacl(Bac-to-Bac system)载体,经杆状病毒同源重组后转染Sf9细胞,Western blot鉴定显示,BaculoGold system表达HA蛋白是分泌型的,而Bac-to-Bac system是胞内表达肚表达效果优于前者;血凝试验证实,这两种表达系统表达的HA蛋白均具有生物学活性.结论 利用杆状病毒表达系统成功表达出具有生物学活性的HA蛋白,Bac-to-Bac system更适合表达HA蛋白,为流感病毒的相关研究提供了保障.

Abstract：

Objective To express functional haemegglutinin(HA)protein in two different bacularvirus expression systems.Methods The whole open reading frame of A/Sichuan/1/2009(H1N1)HA was obtained by synthesis,and the HA protein were expressed in insect cells by two different bacularvius expression systems:BaculoGold system and Bac-to-Bac system. Soluble HA protein was identified by Western blot and haemegglutination test. Results The correct full length of HA gene was obtained and cloned into pAcGP67B and pFAST Bacl vectors,respectively.After 3 rounds of virus amplifyjng by re-infection of Sf9 cells,the HA protein was detected in supematant of BaculoGold system and in intracellular of Bac-to-Bac system which is much better than the former.Purified HA protein was positive not only identified by Western blot,but also detected by haemegglutinin test. Conclusion Functional HA protein was successfully expressed in two distinct bacularvirus expression systems,of which the Bac-to-Bac bacularvirus expression system is more suitable for expression of A/Sichuan/1/2009(H1N1)HA protein.     

SLE患者外周血Vγ9链T细胞受体CDR3特征

为探讨Vγ9链T细胞受体(Tcell receptor,TCR)互补决定区3(complementarity determining region3,CDR3)是否参与自身免疫性疾病中γδT细胞的抗原识别过程,利用基因扫描技术和随机序列测定法对系统性红斑狼疮(systemic lupus er-ythematosus,SLE)患者和健康人外周血Vγ9TCR CDR3区的结构特征进行分析。结果显示,Vγ9CDR3序列的变化主要集中在J区等位基因的取用不同:健康人以表达JγP为主(82.86%),而SLE患者Jγ1/Jγ2(40.82%)和JγP(59.18%)表达率相近。两组人群相比,Jγ1/Jγ2和JγP表达率的差异均具有显著性。结果表明,SLE患者外周血Vγ9链T细胞受体具有与健康人不同的CDR3组成特点,提示其可能参与SLE病理过程中γδT细胞的抗原识别。本研究为寻找SLE中γδT细胞识别的自身抗原以及阐明γδT细胞在SLE中的独特作用奠定了基础。