铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL的纯化表达及活性评价

目的 构建铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL基因的重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达并评价其生物学活性.方法 以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板设计引物,构建pET-28a (+)-PA-ⅠL重组表达质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达,用Ni 亲和层析法对目的蛋白进行纯化.流式细胞术评价重组表达的PA-ⅠL蛋白对细胞表面Gb3/CD77的结合活性,菌落平板计数法评价重组蛋白在细菌黏附宿主细胞过程中的功能.结果与结论 SDS-PAGE电泳显示,纯化后的PA-ⅠL蛋白具有较高的纯度,重组表达的PA-ⅠL蛋白能与细胞表面的糖鞘脂Gb3/CD77结合,且呈浓度依赖性抑制PA的PAO1对宿主细胞的黏附.     

重组人CD80-SEA毒素逆转录病毒真核表达载体的构建

0　引言　肿瘤的免疫基因治疗已成为近年来研究的一个热点 .机体免疫系统抗肿瘤的主要方式是 T细胞介导的免疫排斥反应 ,而 T细胞被激活并杀伤肿瘤细胞依赖于两类信号 ,一类是抗原递呈信号 ,另一类是共刺激信号 .但尚未有人报道将上述两种信号结合在一起有效的应用到肿瘤的治疗当中 .我们通过基因工程手段构建同时表达共刺激分子 CD80和葡萄球菌肠毒素 A(Staphylococcal Enterotoxin A,SEA,一种重要的超抗原 )的逆转录病毒真核表达载体 ,使其表达这两个分子 ,发挥 SEA强特异性激发细胞毒 T淋巴细胞 (CTL )活性和 CD80介导的第二信号…     

乙状窦后入路桥小脑角神经血管显微解剖研究

目的模拟乙状窦后入路的手术操作,观察桥小脑角与听神经瘤相关血管的走行,为手术提供相关依据。方法对16例(32侧)的完整成人尸头通过显微镜模拟手术入路、逐层解剖,观察小脑前下动脉(AICA)及小脑后下动脉(PICA)。结果 32侧均有AICA及PICA。30支AICA起源于基底动脉(BA),占93.75%。25支PICA起自椎动脉上端平橄榄中下1/3平面,占78.75%。结论小脑桥脑角区神经血管差异较大,熟悉其解剖结构,对手术中提高面神经、位听神经的功能保存,降低死亡率有重要意义。     

葡萄球菌肠毒素B突变体(K172E)的制备和抗肿瘤活性分析

目的 :制备葡萄球菌B型肠毒素 (SEB)突变体 ,观察其抗肿瘤活性变化。方法 :将诱导表达的SEB突变体重组蛋白包涵体进行变性复性和分离纯化 ,并对其肿瘤抑制活性与野生型SEB进行比较。观察突变体蛋白的抑瘤效果。结果 :建立了可行的包涵体复性条件和纯化方法 ,获得的突变体蛋白具有明显的抗肿瘤作用 ,其抑瘤活性比野生型SEB至少高 10倍。结论 :获得的突变体SEB K172E的抗肿瘤效果经体外实验证实优于野生型SEB ,有可能成为一种较具潜力的抗肿瘤药物     

二硫键稳定单链抗体融合PE38免疫毒素的构建及活性分析

目的构建二硫键稳定单链抗体(B3dsscFv)融合PE38原核表达载体,实现其高效表达,并对初步纯化后的复性产物的稳定性、对肿瘤细胞的结合和杀伤活性进行测定。方法重叠PCR连接B3抗体的VH和VL片段,并将PCR产物克隆至pET22b表达载体(B3dsscFv-pET22b)。测序正确的PE38基因片段经酶切连接至B3dsscFv-pET22b,构建B3dsscFv-PE38-pET22b表达载体。IPTG诱导转化菌,将表达的包涵体进行变性、复性后用阳离子柱Q-Sepharose进行了初步纯化,ELISA测定此融合蛋白中单链抗体的结合活性及其在37℃的稳定性,并采用MTT法检测其对B3抗原表面阳性细胞HT-29的杀伤作用。结果双酶切鉴定表明成功地构建了B3dsscFv-PE38-pET表达载体,表达产物以包涵体形式存在,占总蛋白量的45%左右。复性后的B3dsscFv-PE38保持单链抗体的结合活性,并且对结肠癌HT-29细胞具有一定的杀伤作用,最大杀伤率可达96%。该蛋白在37℃孵育16h后,仍能保持大部分活性。结论所获B3dsscFv-PE38免疫毒素具备导向和杀伤肿瘤细胞的双重功能和良好的稳定性,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。     

超抗原与超抗原疫苗

超抗原多为某些细菌和逆转录病毒的抗原性代谢产物，对机体的免疫系统有着重要的影响，与人类许多疾病有着极其密切的关系。据超抗原的作用机制，国外最近提出超抗原疫苗的思路，用于防治超抗原引起和介导的疾病，并呈现出较好的苗头。     

重组金葡萄球菌肠毒素B纯化工艺研究

目的建立无降解、高纯度的重组金葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)的纯化工艺,并检测活性以考察纯化工艺对蛋白的影响。方法用PBV220表达载体诱导表达出重组SEB后,采用(NH4)2SO4粗纯—疏水层析—离子交换色谱的组合纯化法纯化该蛋白。纯化后的样品经Western-blot鉴定及动物致死实验检测活性。结果通过该纯化工艺得到了纯度高(纯度>99%),稳定性高的重组SEB,其活性与天然SEB蛋白无明显差异,保持了高活性。结论本实验建立了无降解、高纯度、高活性的重组SEB的纯化工艺,为进一步研究SEB的临床应用打下了基础。     

应用PCR方法检定单核细胞增多性李斯特菌

目的建立单核细胞增多性李斯特菌（单增李斯特菌）快速、敏感、特异的ＰＣＲ诊断方法。方法选取ｈｌｙＡ基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对５４株标准李斯特菌和２１株无关菌进行ＰＣＲ扩增，得到进一步验证。采用ＰＣＲ和常规鉴定方法同时对从国内食品分离的３３株李斯特菌进行鉴定。结果可扩增含有保守ＨｉｎｄⅢ切点的７４３ｂｐ片段。表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为５５个菌。发现其中１８株用两种方法都鉴定为单增李斯特菌，两种方法的结果完全符合。当用于食物标本检测时，ＰＣＲ反应遭强烈抑制。经过２５小时的增菌培养，对培养物进行化学抽提、纯化的菌体经加热裂解后直接用作ＰＣＲ反应模板，可使抑制作用大大降低。每毫升牛奶人工接种４个菌可用该法特异检出。结论建立了ＰＣＲ方法，可初步用于单增李斯特菌的快速、特异、敏感诊断。     

聚合酶链反应检测葡萄球菌肠毒素B基因

金黄色葡萄球菌能分泌 2 0多种毒性蛋白质 ,这些蛋白质是引起人类疾病的主要致病因子 ,其中最重要的是葡萄球菌肠毒素。葡萄球菌肠毒素 (ＳＥ)有 7个血清型[1] ,其中葡萄球菌肠毒素 (ＳＥＢ)在医院感染及食物中毒多见 ,也是生物战毒剂的主要毒素之一[2 ,3] ,它引起的食物中毒占细菌性食物中毒的第 2位。ＳＥＢ的检测常用的方法是免疫法 ,但该方法易产生假阳性或假阴性。由于一些菌株所含有毒素基因表达不好 ,或者缺乏稳定的遗传成分 ,很容易出现假阴性 ;一些菌株血清学试验容易产生交叉反应 ,又常常出现假阳性。近年来发展起来的核酸杂交技…     

猪链球菌H因子结合蛋白截短体的表达、纯化及其结合人血清IgG的活性分析

目的构建带His标签的2型猪链球菌H因子结合蛋白(Fhb)截短表达片段Fhb-N(45-344aa)和Fhb-C(345-664aa)的重组质粒,并在大肠杆菌中表达,获得高纯度的重组蛋白,鉴定其与人血清IgG(hIgG)结合的活性。方法以05ZYH33基因组为模板并设计引物扩增目的片段,构建His-Fhb-N和His-Fhb-C重组表达质粒,利用亲和层析纯化目的蛋白并用Western blot法进行验证。蛋白G亲和层析柱从健康人血清中纯化人IgG(hIgG),Western blot法和生物膜干涉(BLI)鉴定和分析His-Fhb与hIgG结合的活性。结果成功构建了带His标签的原核表达质粒并获得了His-Fhb-N和His-Fhb-C截短表达蛋白,验证出Fhb特异性地与hIgG结合,且结合区域位于Fhb-N(45-344aa)。结论 Fhb能够结合hIgG,结合区域位于Fhb-N。