腺病毒载体介导PDX1在人脐带间充质干细胞中的表达

目的构建含胰十二指肠同源框-1基因（pancreatic and duodenal homeobox factor 1,PDX1）的重组腺病毒载体,并检测其在人脐带间充质干细胞（human umblic cord msenchymal stem cells,HUCM—SCs）的表达情况。方法用BglII／XhoI酶从pUC57-PDX1酶切PDX1,连接到pShuttle—GFP—CMV重组穿梭载体,得到pShutde—GFP—CMV—PDX1重组穿梭质粒,再将pShuttle—GFP—CMV—PDX1转移到pAdxsi载体上,得到pAdxsi—GFP—PDX1病毒质粒,利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞,包装出完整的腺病毒。用重组腺病毒感染HUCMSCs 24h后,经荧光显微镜、RT-PCR、免疫荧光、免疫细胞化学、Western Blot等检测PDX1基因及蛋白的表达。结果通过测序、酶切等鉴定PDX1基因正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒重组,重组腺病毒可高效转染HUCMSCs,RT—PCR检测到PDX1 mRNA在HUCMSCs中表达,经免疫荧光、免疫细胞化学、Western Blot等证实转染PDX1在HUCMSCs胞核中表达。结论成功构建了PDX1腺病毒载体,并在HUCMSCs中有效表达。     

小鼠肝脏部分缺血再灌注过程中Toll样受体2的激活及意义

目的探索Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)在小鼠肝脏部分缺血肝叶中的激活,分析TLR2的激活与肝功能损伤之间的关系.方法BALB/c小鼠复制肝脏部分缺血再灌注(缺血1h再灌注4h)损伤动物模型(I/R组),假手术对照组(SH组)同样行开腹手术但不夹闭血管.采用实时荧光定量PCR(Real-time-PCR)方法定量检测缺血肝叶中TLR2mRNA的表达变化,同时采用Western blot检测缺血肝脏组织中TLR2蛋白的表达变化,检测门静脉血浆丙氨酸氨基转移酶(pALT)水平.结果肝脏部分缺血1h再灌注4h后,I/R组与SH组小鼠缺血肝叶TLR2 mRNA的表达(△Ct值)分别为(1.06±0.91)vs(5.08±1.32)(P＜0.01),由于△Ct值越小则基因表达水平越高,说明缺血再灌注过程中缺血肝叶TLR2mRNA的表达水平增高.且I/R组小鼠缺血肝叶TLR2蛋白的表达(OD值)水平较SH组高[(433.91±25.53)vs(102.86±13.58),P＜0.01],I/R组中门静脉血清ALT水平升高[(848.33±271.37)μ/Lvs(42.39±14.75)μ/L,P＜0.01].结论TLR2在肝脏缺血再灌注过程中缺血肝叶的表达增强,且这种变化与肝功能的损伤相关.     

不同细胞表面TLR4表达对小鼠重症急性胰腺炎中性粒细胞招募的作用

目的 探索髓系细胞(中性粒细胞、血小板)及内皮细胞表面TLR4表达在重症急性胰腺炎中性粒细胞招募中的作用.方法 采用C3H/He-J和C3H/He-N小鼠通过骨髓移植的方法 制作"髓系细胞TLR4 -/- 和内皮细胞TLR4 +/+ "(A组)及"髓系细胞TLR4 +/+ 和内皮细胞TLR4 -/- "(B组)嵌合体小鼠及"髓系细胞TLR4 +/+ 和内皮细胞TLR4 +/+ "(C组)及"髓系细胞TLR4 -/- 和内皮细胞TLR4 -/- "(D组)纯合体小鼠,腹腔注射蛙皮素、尾静脉注射脂多糖复制SAP模型,检测血浆淀粉酶、PCR测外周血粒细胞TLR4、免疫组化检测胰腺组织内TLR4的表达、胰腺组织萘酚AS-D氯乙酸脂酶染色计数、MPO活性.结果 各实验组小鼠血浆淀粉酶升高;B、C两组外周血粒细胞TLR4mRNA表达高于A、D两组(P<0.05);A、C两组胰腺组织内TLR4阳性,B、D两组阴性;A、C两组AS-D计数高于B、D两组;A、C两组MPO活性亦明显高于B、D两组(P<0.05).结论 内皮细胞而非外周血粒细胞在重症急性胰腺炎中性粒细胞招募聚集中起关键作用.     

小鼠肝内源性损伤下TLRs在Kupffer细胞和肝窦内皮细胞中的表达

目的　观察在小鼠内源性损伤模型下肝脏Kupffer细胞 (Kupffercell,KC)和肝窦内皮细胞 (sinusoidalendothelialcells,SEC)表面Toll样受体 2 (TLR2 )蛋白及mRNA表达。方法　在肝部分缺血 再灌注损伤模型下 ,采用原位灌注消化法分离并纯化KC和SEC ,用大鼠抗小鼠TLR2 IgG和异硫氰酸荧光素 (FITC)的二抗进行染色 ,流式细胞仪 (FCM)测定阳性细胞数 ,并用实时定量PCR(Real TimeRT PCR)检测两种细胞中TLR2 mRNA含量。结果　损伤组KCTLR2 的表达明显高于假手术组 ,蛋白质表达为 ( 9.19± 1.0 7) %vs ( 1.5 2± 0 .2 1) % ,P<0 .0 1;mRNA表达为 0 .5 4± 0 .77vs 2 .6 2± 2 .19,P<0 .0 5。SEC差异并无显著性意义。结论　在肝缺血 再灌注损伤中 ,小鼠肝KCTLR2 在蛋白质和mRNA水平的表达明显增高     

重症急性胰腺炎的营养治疗

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)为临床常见的急危重症,是临床治疗的重点及难点,近年来随着对其病理生理的认识及器官支持水平的提高,其并发症率及病死率已明显下降,但据报道病死率仍高达30%.对其治疗除了早期的容量复苏及器官支持治疗外,营养治疗对其预后有重要的意义,以下就目前营养治疗的有关问题进行讨论.     

Notch1信号系统对胰腺癌干细胞增殖与分化的调控

目的 探讨激活的Notch1信号系统对PANC-1胰腺癌干细胞增殖与分化的调控.方法 向体外培养的胰腺癌干细胞中分别加入Notch1激活剂rhNF-κB和抑制剂MW167,空白对照加PBS缓冲液.RT-PCR、Western印迹和流式细胞术等方法 检测Notch1信号系统的表达,及加入激活剂rhNF-κB和抑制剂MW167后,CD44和CD24的表达,以及细胞周期的变化.结果 胰腺癌干细胞中Notch信号系统的4个受体只有Notch1表达,配体只有JAG1表达;对照组的S期和G2期为21.5%和12.7%,使用MW167诱导时,细胞周期的S期和G2期所占的百分比降为17.2%和10.5%,干细胞所表达的CD44和CD24亦显著降低(P<0.05或P<0.01);而使用rhNF-κB诱导,则S期和G2期所占的百分比显著增高为29.3%和15.2%,同时CD44和CD24表达也增高(P<0.05或P<0.01).结论 当Notch信号系统被激活时,胰腺癌干细胞进行增殖;当Notch信号系统被抑制时,胰腺癌干细胞进行分化.     

门静脉高压症病人外周血中一氧化氮浓度变化及其临床意义

门静脉高压症病人外周血中一氧化氮浓度变化及其临床意义同济医科大学附属协和医院普外科（武汉，４３００２２）吴河水王琳仇登波一氧化氮（ＮＯ）是近年发现的一种新的递质，具有重要的生物作用［１］，包括舒张胃肠平滑肌，抑制胃肠蠕动以及舒张血管平滑肌，导致血管扩...     

TLR4 shRNA质粒的构建及稳定转染人胰腺癌PANC1细胞株的筛选

目的 构建靶向人TLR4基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,转染胰腺癌细胞,并筛选出稳定转染的克隆细胞株.方法 采用小分子干扰RNA(siRNA)软件设计3个靶向TLR4基因的shRNA,构建3个质粒表达载体,分别命名为TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3;选取抑制效率最高的shRNA质粒,采用脂质体法转染胰腺癌PANC1细胞;实时定量PCR和流式细胞技术检测细胞TLR4 shRNA基因沉默效率和转染效率;G418抗性筛选和有限稀释单克隆形成法挑选培育稳定转染TLR4 shRNA的单克隆细胞系.结果 转染48 h后PANC1细胞瞬时转染效率为(46.72±5.06)％.转染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的细胞的TLR4mRNA表达水平分别为0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006,均显著低于未转染组的0.061±0.018和阴性对照转染组的0.057±0.015(P值均＜0.05).以沉默效果最佳的TLR4-3转染细胞所获得的稳转细胞的转染效率为(82.79 ±8.16)％,较瞬转细胞显著提高(P=0.001);TLR4 mRNA表达水平为0.010±0.002,较瞬转细胞显著下调(P=0.001);TLR4蛋白表达率为(0.54±0.32)％,显著低于未转染细胞的(87.42±5.00)％和转染阴性对照细胞的(82.90±5.00)％(P=0.000).结论 成功筛选到TLR4基因沉默的稳转PANC1细胞.