氯喹减轻重症急性胰腺炎肝损伤的机制研究

目的：探讨氯喹（CQ）减轻重症急性胰腺炎（SAP）肝损伤作用的机制。方法：60只Wistar雄性大鼠分为假手术组,SAP组,L-Arg治疗组,L-NAME治疗组,CQ治疗组,CQ+ L-NAME治疗组,每组各10只。RT-PCR和Western Blot检测肝组织TLR4的表达。结果：SAP 组肝组织TLR4表达明显增高,一氧化氮（NO）浓度降低,肝损伤加重(P<0.05)。L-Arg组NO升高,TLR4表达受抑,肝损伤减轻(P<0.05)。L-NAME组NO明显抑制,肝组织TLR4表达升高,肝损伤加重(P<0.05)。CQ组TLR4表达降低,肝组织NO升高,肝损伤减轻(P<0.05)。CQ+L-NAME组肝组织NO明显降低,TLR4升高,肝损伤加重(P<0.05)。结论：TLR4表达上调在SAP肝损伤的发生、发展中可能有重要作用。CQ可能通过提高NO的合成和释放而抑制TLR4的表达,减轻SAP并发肝损伤。     

MT2-MMP基因沉默对缺氧条件下培养的胰腺癌AsPC-1细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响

目的 利用特异性siRNA沉默人胰腺癌AsPC-1细胞的膜型金属蛋白酶2（MT2-MMP）基因表达,观察其对缺氧条件下培养的细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响.方法 采用脂质体转染法将插入MT2-MMP特异性siRNA的真核表达质粒转染至人胰腺癌AsPC-1细胞株（siRNA组）,以转染过表达MT2-MMP质粒（过表达组）或阴性对照质粒（空载体组）的AsPC-1作为对照.实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测转染细胞的MT2-MMP mRNA和蛋白的表达.在缺氧条件（37℃、1％O2、5％ CO2、饱和湿度的三气培养箱）下培养后,应用CCK-8法检测转染细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡,Transwells小室检测细胞的侵袭能力.结果 成功获取MT2-MMP基因沉默的AsPC-1细胞株和过表达的细胞株.缺氧条件下培养24h后,空载体组、过表达组、siRNA组细胞增殖的吸光度值（A490值）分别为0.68±0.08、0.80 ±0.08、0.52±0.07;细胞凋亡率分别为（6.2±1.5）％、（2.8±1.1）％、（21.4±3.9）％;每个视野（200倍）的穿膜细胞数分别为（115.8 ±23.2）、（256.4±38.6）、（45.8±18.2）个.siRNA组较空载体组的细胞增殖显著被抑制,穿膜细胞数显著减少,而细胞凋亡率显著增加（P值均＜0.05）.过表达组较空载体组的细胞增殖显著增强,穿膜细胞数显著增加,而细胞凋亡率显著降低（P值均＜0.05）.结论 MT2-MMP基因沉默的AsPC-1细胞在缺氧条件下培养后细胞凋亡增加,增殖被抑制,侵袭力减弱.     

小鼠肝脏部分缺血再灌注过程中Toll样受体2的激活及意义

目的探索Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)在小鼠肝脏部分缺血肝叶中的激活,分析TLR2的激活与肝功能损伤之间的关系.方法BALB/c小鼠复制肝脏部分缺血再灌注(缺血1h再灌注4h)损伤动物模型(I/R组),假手术对照组(SH组)同样行开腹手术但不夹闭血管.采用实时荧光定量PCR(Real-time-PCR)方法定量检测缺血肝叶中TLR2mRNA的表达变化,同时采用Western blot检测缺血肝脏组织中TLR2蛋白的表达变化,检测门静脉血浆丙氨酸氨基转移酶(pALT)水平.结果肝脏部分缺血1h再灌注4h后,I/R组与SH组小鼠缺血肝叶TLR2 mRNA的表达(△Ct值)分别为(1.06±0.91)vs(5.08±1.32)(P＜0.01),由于△Ct值越小则基因表达水平越高,说明缺血再灌注过程中缺血肝叶TLR2mRNA的表达水平增高.且I/R组小鼠缺血肝叶TLR2蛋白的表达(OD值)水平较SH组高[(433.91±25.53)vs(102.86±13.58),P＜0.01],I/R组中门静脉血清ALT水平升高[(848.33±271.37)μ/Lvs(42.39±14.75)μ/L,P＜0.01].结论TLR2在肝脏缺血再灌注过程中缺血肝叶的表达增强,且这种变化与肝功能的损伤相关.     

全身炎症反应综合征小鼠肝脏Toll样受体2,4基因的表达

目的观察Toll样受体(TLR)2,4基因在全身炎症反应综合征(SIRS)小鼠肝脏中的表达,探讨TLR2,4在SIRS发病机制中的作用。方法BABL/C小鼠40只,随机分为对照组和SIRS模型组,每组各20只。按急性重症胰腺炎方法复制SIRS鼠模型。进行血常规和血生化检查(血淀粉酶、谷丙转氨酶等),监测体温。取其胰腺和肝脏观察组织病理学改变。实时荧光PCR法检测肝脏TLR2,4mRNA的表达,Westernblot法检测肝脏TLR2,4蛋白的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肝脏肿瘤坏死因子(TNFα)和白细胞介素(IL)6的表达。结果SIRS鼠胰腺和肝脏组织可见不同程度出血、坏死,伴有炎性细胞浸润。血清淀粉酶和谷丙转氨酶增高,还可见体温和白细胞计数下降。SIRS鼠肝脏TLR2,4mRNA和蛋白表达明显增加,TNFα和IL6的表达亦显著升高,与对照组相比较,差异有显著性(P<0.01)。结论SIRS鼠肝脏TLR2,4基因及其下游炎症因子TNFα和IL6表达明显增加,提示TLR信号通路可能与SIRS的发生发展密切相关,从而为防治SIRS提供了新的思路和必要的理论依据。     

小鼠肝缺血再灌注后Toll样受体2在缺血肝组织中的激活及其意义

目的　探索小鼠肝缺血再灌注后缺血肝组织中Toll样受体 2 (TLR2 )的激活及其与肝功能损伤之间的关系。方法　缺血再灌注损伤组 (I/R组 ),假手术对照组 (S组 )均采用实时荧光定量多聚酶链反应检测肝组织中TLR2mRNA及TLR2蛋白的表达,同时检测门静脉血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肿瘤坏死因子α(TNF α)及门静脉血清内毒素 (endotoxin, EN)水平。结果　肝脏部分缺血1h再灌注 4h后,I/R组与S组小鼠缺血肝组织TLR2 mRNA的表达 (ΔCt值 )分别为 1. 0 6±0. 9 1和5. 0 8±1. 3 2, 两组间差异有显著性 (P < 0. 0 1 ),I/R组缺血肝组织TLR2 蛋白的表达 (OD值 )( 4 3 3. 9 1±2 5. 5 3 )水平较S组 ( 1 0 2. 8 6±1 3. 5 8 )显著升高 (P< 0. 0 1 )。I/R组门静脉血清TNF α[ ( 1 1 2. 5 2±1 4. 4 1 )pg/mL]较S组 [ ( 5. 9 6 ±4. 4 3 )pg/mL]显著升高 (P < 0. 0 1 );I/R组ALT[ ( 8 4 8. 3 3±2 7 1. 3 7 )U/L]较S组 [ ( 4 2. 3 9±1 4. 7 5 )U/L]显著升高 (P < 0. 0 1 );而门静脉血清内毒素水平组间差异无显著性 (P> 0. 0 5 )。结论　TLR2mRNA及蛋白在肝脏缺血再灌注过程中缺血肝组织的表达增强, 此变化伴有TNF α的升高及肝功能的损伤。     

甲状腺癌误诊误治的原因分析及处理策略（附42例报告）

目的　探讨造成甲状腺癌误诊误治的原因及提出相应的处理策略。方法　对 1990～2 0 0 2年误诊误治的 4 2例甲状腺癌的诊断治疗过程进行回顾性分析。结果　误诊误治的原因主要有 :询问病史不全面、只追求片面的症状 ;术前无详细的体检和必要的特殊检查 ,过分相信经验 ;忽略了术中冰冻切片的重要性 ,过分依赖细针穿刺细胞学检查 ;忽视了甲状腺癌常与甲状腺良性疾病共存的临床现象。结论　规范化、程序化的诊疗过程是最大程度减少或避免甲状腺癌误诊误治的关键     

PI3K/mTOR信号通路参与胰腺肿瘤干细胞样SP细胞生存增殖的调控

目的 分离鉴定胰腺癌中肿瘤干细胞样的侧群(SP)细胞亚群并探讨磷脂酰肌醇3-激酶/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/mTOR)信号通路对其生存与增殖的调控.方法 应用流式分析检测5个胰腺癌细胞系中SP细胞的含量.观察加入PI3K/mTOR)R信号通路特异性抑制剂LY294002或雷帕霉素培养后胰腺癌细胞PANC-1中SP细胞的含量变化.通过平板集落形成试验,NOD-SCID小鼠异种移植成瘤试验和移植瘤的SP再次分析评价PANC-1 SP细胞的自我更新和分化潜能.采用 MTT试验和集落形成试验检测LY294002或雷帕霉素对分选的SP细胞和非SP细胞的抑制作用.结果 除了BXPC-3,其他胰腺癌细胞系都存在维拉帕米敏感的SP细胞.SP细胞具有较高的集落形成能力(SP细胞:43.7%±3.1%,非SP细胞8.3%±1.6%,P=0.000)和成瘤能力(至少100倍于非sP细胞),并能够发生不对称分裂生成非SP细胞.加入LY294002或雷帕霉素培养后PANC-1中sP细胞的含量明显降低(LY294002,7.60%±0.27% vs 1.90%±0.22%,P=0.000;雷帕霉素,7.60%±0.27%vs 1.14%±0.20%,P=0.000).与非SP细胞相比,LY294002及雷帕霉素均优先抑制sP细胞.结论 SP细胞富集胰腺癌肿瘤干细胞.PI3K/mT0R信号通路参与对其生长增殖的调控,可能成为根治胰腺癌的治疗新靶点.     

氯化钆对内毒素刺激后小鼠巨噬细胞Toll样受体表达的影响

目的观察氯化钆(GdCl3)对内毒素刺激后的小鼠巨噬细胞来源的细胞系RAW264.7细胞Toll样受体(TLRs)表达的影响。方法RAW264.7细胞分为空白组、内毒素处理组(LPS组)及GdCl3处理组(GdCl3组),采用流式细胞仪检测TLR2/4蛋白表达情况;用逆转录PCR(RT-PCR)法分析细胞中TLR2/4mRNA表达的变化;用ELISA检测细胞培养上清液中TNF-α的水平。结果与LPS组相比,不同浓度的GdCl3作用于RAW264.7细胞后,其TLR2/4蛋白和基因的表达以及TNF-α的表达水平均明显下降,在观察浓度范围内以2000μmol/L时最明显,TLR2/4蛋白:200μmol/L时为(70.2±1.28)%/(66.7±2.59)%,400μmol/L时为(64.9±1.43)%/(60.4±1.25)%,2000μmol/L时为(47.4±0.98)%/(32.1±0.74)%,其与LPS组的(94.4±1.76)%/(95.7±0.87)%比较,P<0.01;TLR2/4mRNA(A值):200μmol/L时为(76.42±2.76)/(101.72±3.14),400μmol/L时为(75.60±3.76)/(89.65±5.17),2000μmol/L时为(64.22±4.67)/(78.44±4.88),其与LPS组的(127.64±3.25)/(119.82±5.59)比较,P<0.05,P<0.01;TNF-α:200μmol/L时为(2540±77)pg/ml,400μmol/L时为(2041±106)pg/ml,2000μmol/L时为(1020±220)pg/ml,其与LPS组的(4688±127)pg/ml比较,P<0.01。结论GdCl3能明显抑制内毒素引起的RAW264.7细胞Toll样受体的表达及相应炎症因子的生成。     

Inhibition of RAW264.7 Macrophage Inflammatory Cytokines Release by Small Haparin RNAi Targeting TLR4

In order to construct an expression vector carrying small hairpin (sh) RNA (shRNA) for toll-like receptor 4 mRNA and a reporter gene of enhanced green fluorescence protein (EGFP) and study the inhibition of cytokine release by RAW264.7 cell induced by lipopolysaccharide (LPS) stimulation through transfection and expression of shRNA targeting TLR4 gene via the RNAi mechanism, the reporter gene plasmid pEGFP-C1 (4.7 kb) and psiRNA-hHlneo (2979 bp) were used. The H1 promotor and double Bbs I restrict endoenzyme site were cloned from plasmid psiRNA-hH1neo and reconstructed them into plasmid pEGFP-C1 in the Mlu I restrict endoenzymic site, forming plasmid pEGFP-H1/siRNA, which contained Bbs site and reporter EGFP gene. Then an oligonuclear hairpin sequence targeting TLR4 gene was designed by internet tool and inserted into the plasmid pEGFP-H1/siRNA forming plasmid pEGFP-H1/TLR4-siRNA. After transfection of pEGFP-H1/TLR4-siRNA into RAW264.7 cells, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) release by the cells after stimulation by LPS was detected. The results showed that the constructed pEGFP-H1/TLR4-siRNA carrying hairpin RNA for TLR4 gene and reporter EGFP gene were proven to be right by restriction endonuclease analysis. The expression of EGFP gene was (50.37±8.23) % and after transfection of the plasmid pEGFP-H1/ TLR4-siRNA the level of TNF-αreleased by RAW264.7 cell was down regulated. It was concluded that shRNA targeting TLR4 gene could inhibit the TNF-αrelease by RAW264.7 cells evoked by LPS.     

胰腺癌诊治进展

胰腺癌是一种较少见的恶性肿瘤,发病率呈逐年升高的趋势.胰腺癌早期无特异性的临床表现,如何早期诊治仍是胰腺癌综合治疗亟待解决的问题.近年来,随着影像学技术的发展和外科治疗手段的进步,包括腹腔镜以及机器人系统在胰腺癌手术中的应用,促进了胰腺癌外科治疗理念的进步.此外,对于可能切除胰腺癌,术前的新辅助化疗也使更多的病人获得了根治性切除,大幅度提高了病人的生存时间.