辐射小鼠骨髓CD34~ 细胞的变化及其意义

目的　研究γ射线照射后C5 7小鼠骨髓中CD34 细胞的数量变化规律及其意义。方法　流式细胞仪测定CD34 细胞在骨髓有核细胞中的比例 ;AnnexinV FITC试剂盒检测骨髓细胞的凋亡 ;细胞固定后PI染色测定细胞周期。结果　①CD34 细胞在骨髓有核细胞中的比例随照射剂量的加大而降低 ,在 5 5Gy照射后 14d内小鼠CD34 细胞的减少表现为持续性 ;②小鼠照射后6h骨髓细胞凋亡率最高 ,以 5 5Gy照射组最为明显 ;③ 5 5Gy照射后小鼠骨髓细胞周期紊乱。 结论　γ射线损伤骨髓中的干祖细胞 ,造成骨髓中干祖细胞的数量减少 ,其途径之一是诱导骨髓细胞凋亡。     

CHO-hGPR91工程细胞株的构建及鉴定

目的构建携带hGPR91蛋白表达序列的pcDNA3.1(+)-hGPR91表达载体,并将其转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中,经筛选获得CHO-hGPR91工程细胞株,并对工程细胞株表达受体功能进行初步鉴定。方法采用PCR法扩增hGPR91全长开放阅读框,通过T4连接酶将其连接到载体pcDNA3.1(+)上,再通过Lipofectamine 2000将重组载体转染入CHO细胞中,并以抗生素G418加压筛选,RT-PCR及Western印迹法检测工程细胞株中hGPR91 mRNA及蛋白的表达情况,以Fluo4-AM荧光染料检测琥珀酸对细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响。结果所构建CHO-hGPR91工程细胞株能够成功表达hGPR91的mRNA及蛋白,在琥珀酸的刺激下能够明显引起工程细胞株[Ca2+]i的变化;而空载体pcDNA3.1(+)转染CHO细胞所得的CHO-pcDNA3.1(+)细胞则无上述效应。结论成功构建了CHO-hGPR91工程细胞株,琥珀酸作为GPR91的特异性配体,能够明显改变工程细胞株的[Ca2+]i,为进一步研究GPR91的功能及针对以GPR91为靶点的药物研发奠定了基础。     

PPARγ依赖和非依赖途径参与吡格列酮对人肝癌细胞的增殖抑制作用

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）特异性外源配体吡格列酮（Pio）对体外培养的HepG2细胞增殖作用的影响,并探讨其是否通过PPARγ依赖途径发挥作用。方法将不同浓度的Pio作用于体外培养HepG2细胞,MTT比色法检测HepG2细胞增殖情况,3H-TdR掺入实验检测细胞DNA合成速率,采用RT-PCR和Western印迹检测PPARγmRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞周期;同时观察PPARγ特异性拮抗剂GW9662和（或）瞬时转染pSG5-PPARγ真核表达质粒、PPARγ小干扰RNA（pGCsi-PPARγ）表达质粒稳定转染对Pio细胞增殖作用的影响。结果 Pio作用于HepG2细胞后,导致HepG2细胞的增殖受到抑制、DNA合成速率减慢,呈一定的剂量依赖关系;在此过程中,G0/G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少,但PPARγmRNA和蛋白的表达没有显著变化;GW9662可以部分拮抗Pio的增殖抑制效应,但转染pSG5-PPARγ真核表达质粒可以逆转GW9662的作用;利用pGCsi-PPARγ表达质粒将PPARγ基因沉默后,Pio在高浓度（20μmol/L）时亦表现出细胞增殖抑制作用。结论 Pio能够抑制HepG2细胞的增殖,该作用与其诱导细胞G0/Gl期的停滞有关,PPARγ依赖和非依赖途径参与上述过程。     

吡格列酮对HepG2细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

目的观察吡格列酮对体外培养的HepG2细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其是否通过PPARγ依赖途径发挥上述药理作用。方法将不同浓度的吡格列酮作用于体外培养HepG2细胞,以MTT比色法检测HepG2细胞增殖情况,以3H-TdR参入实验检测细胞DNA合成速率,采用RT-PCR和Western blot检测PPARγmRNA和蛋白的表达,以流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;同时观察PPARγ特异性拮抗剂GW9662和(或)瞬时转染pSG5-PPARγ真核表达质粒对吡格列酮细胞增殖作用的影响;并将PPARγ小干扰RNA(pGCsi-PPARγ)表达质粒稳定转染HepG2细胞,观察PPARγ沉默后吡格列酮对HepG2细胞增殖作用的影响。结果吡格列酮作用于HepG2细胞后,导致HepG2细胞的增殖受到抑制、DNA合成速率减慢,并诱导细胞凋亡,呈一定的剂量依赖关系;在此过程中,G0/G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少,但PPARγmRNA和蛋白的表达没有变化;GW9662部分拮抗吡格列酮的增殖抑制作用,但转染pSG5-PPARγ真核表达质粒可以逆转GW9662的作用;吡格列酮在高浓度(20μmol.L-1)时对pGCsi-PPARγ表达质粒稳定转染的HepG2细胞仍表现出增殖抑制作用。结论吡格列酮能够抑制HepG2细胞的增殖并诱导凋亡,具有潜在的抗瘤作用,这种作用与其诱导细胞G0/G1期的停滞有关,PPARγ依赖和非依赖途径参与上述过程。     

PPARγ激动剂吡格列酮对尿酸钠晶体诱导炎症的防治作用

目的通过尿酸钠(MSU)晶体诱导的炎症动物模型,探讨炎性细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达的规律及其激动剂吡格列酮防治痛风的可行性及机制.方法选用Wistar大鼠和昆明小鼠作为实验对象,相应部位注射MSU晶体制作大鼠急性腹膜炎和小鼠皮下气腔炎症模型.在大鼠腹膜炎实验中,以半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)动态检测PPARγ在炎症发生发展过程中腹腔巨噬细胞的表达规律,检测炎症诱导后4、8、24、48 h不同组别大鼠腹腔浸润的炎性细胞数变化,以评价吡格列酮的抗炎作用;在皮下气腔炎症实验中,观察不同剂量吡格列酮对小鼠皮下气腔炎症不同时间点浸润的炎性细胞数的影响.结果PPARγ在正常大鼠腹腔巨噬细胞的表达明显高于外周血单个核细胞和中性粒细胞,在MSU诱导的急性腹膜炎大鼠的腹腔巨噬细胞中表达迅速降低,并与炎性细胞数呈显著负相关,随炎症缓解而趋恢复.MSU诱发的腹膜炎自发缓解早于皮下气腔炎症.在大鼠腹膜炎模型,20mg·kg-1·d-1的吡格列酮在4 h和8 h即可显著抑制炎性细胞浸润,抑制率分别为70.6%和64.5%;在小鼠皮下气腔炎症模型,20 mg·kg-1·d-1和10 mg·kg-1·d-1的吡格列酮在48 h方可显著减少炎性细胞浸润,抑制率分别为49.3%和42.4%,而4 mg·kg-1·d-1吡格列酮无明显作用.结论PPARγ参与了MSU诱导的痛风相关炎症过程.吡格列酮可减轻MSU诱导的动物体内炎症反应,该作用在MSU诱导的大鼠腹膜炎早期即可出现,而在小鼠皮下气腔模型诱导后48 h才表现出来.吡格列酮的上述抗炎作用可能主要通过巨噬细胞实现.     

吡格列酮对大鼠肥大心肌细胞炎性细胞因子表达的影响

目的探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)激活剂吡格列酮对体外肥大心肌细胞炎性细胞因子表达水平的影响。方法体外培养新生Wistar大鼠心肌细胞,以血管紧张素Ⅱ刺激建立心肌细胞肥大模型,培养的心肌细胞分为3组,正常对照组,肥大模型组,吡格列酮组(51、0、20μmol/L)。用软件分析心肌细胞表面积,3H-亮氨酸掺入检测心肌细胞蛋白合成速率,采用半定量逆转录聚合酶链反应法检测心肌细胞肥大特征性基因心钠肽(ANP),脑钠肽(BNP),炎性细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β),白细胞介素-6(IL-6),基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9以及PPARγ的mRNA表达。结果血管紧张素Ⅱ诱导后,心肌细胞表面积、ANP、BNP的mRNA表达以及蛋白合成速率增加;IL-1β,IL-6,MMP2,MMP9的mRNA表达也增加;PPARγ的mRNA表达下降。吡格列酮可以逆转心肌细胞肥大,下调ANP、BNP和炎性细胞因子及MMPs的mRNA表达,增加PPARγ的mRNA表达,并呈一定的剂量依赖性。结论吡格列酮能够抑制大鼠心肌细胞肥大,这一作用可能与其增加PPARγ的mRNA表达,下调炎性细胞因子的表达有关。     

他汀类药物防治心肌肥厚的分子机制的研究进展

心肌肥厚是引起心血管疾病发生率和死亡率显著升高的独立的危险因素。他汀类药物是目前临床应用最广泛、最有效的降脂药物，其通过调控细胞外的刺激信号、细胞内的信号转导和细胞核内的基因转录的活化等多个信号传导环节，影响小三磷酸鸟苷结合蛋白、丝裂素活化蛋白激酶、肾素-血管紧张素系统和过氧化物酶体增殖物激活受体途径的活性，增加一氧化氮水平并发挥抗氧化应激和抗炎作用，从而阻止心肌肥厚的发生、发展，降低心脏疾病的死亡率。他汀类药物的上述作用为心肌肥厚的防治提供了新的可能性。     

DBA／1小鼠胶原诱发关节炎模型的特征及鉴定

目的 建立胶原诱发关节炎（CIA）的DBA／1小鼠模型，对其发病特点、临床表现特征及病理学变化分别予以分析，为相关药物疗效评价提供合适模型。方法 将牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂充分乳化，在DBA／1小鼠尾根部2～3cm处皮内注射100μl混合乳剂，3周后再重复注射等量乳剂，动态观察小鼠的临床表现，如肿胀程度、炎症指数和体重变化等，对中晚期发病关节进行组织病理学检测。结果 在首次免疫后28d左右，胶原注射小鼠踝关节开始出现明显红肿，5～6周肿胀厚度达到最高为（3．42±0．34）mm，小鼠的CIA发生率为100％，病理学结果显示，患病关节表现出周围炎性细胞浸润、滑膜增生、软骨和骨骼破坏等较为典型的变化；正常对照组小鼠则无上述表现；地塞米松磷酸钠注射液治疗组小鼠的上述表现明显减轻。结论 DBA／1小鼠皮下注射牛Ⅱ型胶原，可成功诱导CIA模型，而且发生率为100％，该模型在临床发病特点、组织病理学改变等方面，较充分模拟了人类RA的病变特征，适用于开展RA防治药物或其机制的实验研究。     

基因突变的分子生物学方法检测及其在新药临床前遗传 …

对基因突变检测的常用分子生物学方法，包括单链构象多态性（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＣＰ）检测，异源双链核酸分子分析（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＨＤＡ）蛋白截短试验（ｐｒｔｏｅｉｎ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ＰＴＴ）和错配化学裂解法（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｍｉｓｍａｔｃｈ，ＣＣＭ）等进行了综述；详尽