HSV-2333株在Vero细胞中持续感染及增殖特性研究

[目的]探讨单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）在非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）中感染及增殖的特性。【方法】将HSV-2接种于Vero细胞中培养和传代,制备电镜样品观察,于不同时间收获病毒液并测毒力,进行pH值、血清以及在Vero细胞传代、不同感染复数等不同培养条件的摸索。【结果】pH值、残留牛血清是HSV-2在Vero细胞培养的影响因素,最佳收毒时间为36-72h。在Vero细胞上培养病毒3-5代,病毒毒力较高。【结论】建立了HSV-2在Vero细胞上培养增殖的初步方法,为下一步建立HSV-2的潜伏与激发细胞模型打下基础。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞中培养与增殖特性的研究

目的研究单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）在非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）中培养及增殖的合适条件。方法把HSV-2接种于Vero细胞中培养和传代,于不同时间收获病毒液并测毒力,进行不同培养条件的摸索。结果pH值、残留牛血清是HSV-2在Vero细胞培养的影响因素,最佳收毒时间为36-72h。在Vero细胞上培养病毒3-5代,病毒毒力较高。结论建立了单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞上培养增殖的初步方法,为下一步建立HSV-2的潜伏与激发细胞模型打下基础。     

逆转录病毒载体介导的RNAi抑制乳腺癌细胞BSP基因表达

目的 构建抑制人BSP基因表达的RNA干扰逆转录病毒载体,筛选建立稳定抑制BSP表达的MDA-MB-231BO细胞系.方法 构建靶向人BSP基因的逆转录病毒重组质粒pSilencer-BSP27、pSilencer-BSP81和pSilencer-BSP100.将其包装成病毒后感染MDA-MB-231BO细胞.用RT-PCR和Western印迹检测成功感染细胞(231BO-BSP27、231BO-BSP81、231BO-BSP100细胞)BSP基因的抑制效果.结果 双酶切和测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完全相同.RT-PCR和Western印迹结果显示231BO-BSP27、BO-BSP81和231BO-BSP100细胞BSP基因在mRNA水平和蛋白水平抑制效率分别为:70.8 %、79.4 %和30.1 %;69.3 %,75.2 %和27.8 %.结论 成功构建抑制人BSP基因表达的RNAi逆转录病毒载体pSilencer-BSP27、pSilencer-BSP81和pSilencer-BSP100.获得高效稳定抑制BSP表达的231BO-BSP27、231BO-BSP81细胞系.     

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的荧光真核表达载体，以便进一步转染成骨细胞，研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C3，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况，观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光；免疫组化检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP-C3-bFGF，并在3T3细胞中表达了bFGF。     

抗rhANG多克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备抗重组人血管生长素(recombinant human angiogenin，rhANG)多克隆抗体，并初步应用于消化道肿瘤实验研究。方法 用重组基因工程菌表达，SDS法纯化的rhANG蛋白免疫新西兰兔，制备并纯化多克隆抗体，并用免疫组织化学和ELISA等方法对多克隆抗体进行测定。结果 此次获得的抗血清ELISA方法效价达1：12800，检测ANG灵敏度最低为8～16μg／L，不与其他细胞因子和血清反应。该抗体与20％～30％消化道恶性肿瘤呈阳性反应。结论 ANG多克隆抗体对表达ANG的肿瘤组织反应特异性强，ELISA方法检测灵敏度高，该抗体可用于ANG的检测。     

血管生长素在前列腺癌和前列腺良性增生组织中的表达

目的研究血管生长素（angiogenin，ANG）在前列腺癌和前列腺良性增生组织中的表达及其与前列腺癌生物学行为的关系。方法采用免疫组化SP法对68例前列腺癌组织和38例前列腺良性增生组织标本ANG蛋白的表达进行检测，并对不同的年龄组、病理分级、临床分期之间的表达差异通过统计学分析进行比较。结果免疫组化实验显示阳性染色为棕黄色和深棕色颗粒。ANG在前列腺癌组织中表达显著高于前列腺良性增生组织（P〈0.01）。ANG表达随前列腺癌患者临床分期的升高而上调（P〈0.05）;随着肿瘤组织Gleason病理分级的增加而呈升高趋势（P〈0.05）;而在不同年龄组前列腺癌患者之间ANG表达无统计学差异（P〉0.05）。结论前列腺癌组织中ANG的表达在判断前列腺癌侵袭性、估计其预后中有一定意义。     

白细胞介素12基因修饰大鼠胶质瘤9L/rIL-12细胞的建立

目的 构建大鼠白细胞介素12（rIL-12）基因真核表达载体质粒,建立rIL-12基因修饰并稳定表达的大鼠胶质瘤9L/rIL-12细胞.方法 用Trizol提取大鼠腹腔巨噬细胞总RNA,RT-PCR方法分别获取rp40和rp35 cDNA,依次克隆人pcDNA3.1（-）/mycHis A质粒中,以IRES连接双亚基,构建成双顺反子真核表达载体质粒pcDNA3.1/rIL-12.将构建的重组质粒转染大鼠胶质瘤9L细胞,G418筛选单克隆细胞株,ELISA法检测其培养上清rIL-12（p70）蛋白含量,同时抽提细胞RNA,RT-pCR方法检测rp40、rp35基因在9L/rIL-12细胞中的表达.结果 所得rp40cDNA序列与Gene Bank NM022611及AF133197、rp35cDNA序列与Gene Bank NM053390及AF177031均一致,构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确.质粒转染9L细胞后,获得2个rIL-12基因稳定、高效表达的9L/rIL-12单克隆细胞株,其培养上清rIL-12（p70）蛋白含量分别为139.0、162.1 pg/ml,RT-PCR结果显示细胞中rIL-12基因表达呈阳性.结论 成功构建了rIL-12真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12,并建立了9L/rIL-12细胞株,为rIL-12基因修饰的胶质瘤疫苗研究打下了基础.     

骨涎蛋白单克隆抗体抑制亲骨转移人乳腺癌细胞血管侵袭机制的探讨

目的:探讨骨涎蛋白(BSP)单克隆抗体对亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-23180血管侵袭能力的影响.方法:MTT法检测BSP抗体对MDA-MB-231BO细胞的增殖作用;鸡胚尿囊绒膜(CAM)实验检测BSP抗体对MDA-MB-231BO细胞血管侵袭能力的影响.结果:BSP抗体对MDA-MB-231BO细胞的生长具有特异抑制作用,其抑制率和剂量呈正相关,BSP抗体浓度为100 μg/mL时,抑制率为35.18%.BSP抗体能特异性抑制MDA-MB-231BO细胞穿透鸡胚血管内皮细胞和基底膜,抑制效应与抗体浓度呈正相关.100μg/mL的BSP抗体可以明显抑制MDA-MB-231BO细胞侵入鸡胚血管.结论:BSP抗体对MDA-MB-231BO细胞的血管侵袭能力具有特异抑制作用,提示BSP抗体可抑制乳腺癌靶向骨转移的进程.     

胰岛素样生长因子及其Ⅰ型受体抗体对人肾上腺皮质癌SW-13细胞株体外生长的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子及其Ⅰ型受体抗体对人肾上腺皮质癌SW-13细胞株体外生长的影响.方法 采用MTT法描绘不同浓度胰岛素样生长因子及其Ⅰ型受体抗体作用后SW-13细胞株体外培养生长的促进及抑制曲线,并比较不同浓度胰岛素样生长因子和其Ⅰ型受体抗体组及单一胰岛素样生长因子或其Ⅰ型受体抗体组与阴性对照组之间的差异.结果 胰岛素样生长因子能明显促进SW-13细胞增殖,其作用效果与作用浓度在一定浓度范围内呈正相关(P＜0.05);而胰岛素样生长因子Ⅰ型受体抗体能抑制胰岛素样生长因子对SW-13细胞的刺激作用,并且对SW-13细胞的增殖亦有直接抑制的作用(P＜0.05).结论 胰岛素样生长因子可促进SW-13细胞株的生长,而这种作用亦是通过胰岛素样生长因子Ⅰ型受体传导;胰岛素样生长因子Ⅰ型受体抗体可明显抑制这种生物学作用,可能在肾上腺皮质癌的治疗中发挥重要作用.     

木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化及其杀伤鼠肝癌细胞的作用

目的研究木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化工艺及其对鼠肝癌细胞hepa 6的杀伤作用。方法采用羧甲基纤维素离子交换色谱分离纯化木瓜凝乳蛋白酶 ,超滤浓缩后冷冻干燥。溴化四唑蓝 (MTT)法检测酶对鼠肝癌细胞的活性。结果分离纯化得到的木瓜凝乳蛋白酶比活为 5 5 4 2 .2IU/mg ,具有显著的抑瘤作用 ,呈浓度依赖性。结论该法分离纯化的木瓜凝乳蛋白酶比活高 ,体外杀伤鼠肝癌细胞作用显著。