Notch1信号途径在食管鳞癌细胞株EC9706的作用研究

目的：研究Notch1基因在食管癌细胞株中的表达及其对食管鳞癌细胞EC9706凋亡的影响.方法：通过免疫细胞化学检测Notch1基因在EC9706细胞中的表达.通过RT-PCR扩增Notch1基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Notch1,转染EC9706细胞,利用Western blotting检测转染pcDNA3.1-Notch1载体12h,24h,48h,72h的食管癌细胞株与转染空载体食管癌细胞株中Notch1的表达,并观察每一时期食管癌细胞株的凋亡情况.结果：在食管癌细胞株中Notch1基因低表达,此外,转染Notch1后的细胞株Notch1表达量与转染空载体相比有明显差异（F=80.442,P＜0.05）.经组间两两比较,实验组食管癌细胞株的Notch1的表达量在12h时比对照组食管癌细胞株的表达量显著增高（P＜0.01）,前者约为后者的4.6倍.但48h至72h时Notch1表达量实验纽与对照组食管癌细胞株无显著性差异（P＞0.05）.进一步通过倒置显微镜发现48h至72h细胞出现大量凋亡的现象.上述结果说明12h Notch1表达量的增加,使食管癌细胞EC9706中的Notch1信号途径得以激活,该途径激活后导致48h到72h时的细胞大量凋亡.结论：Notch1在食管癌细胞中的激活引起细胞大量凋亡,提示Notch1基因有可能成为治疗食管癌的新靶点.     

雷帕霉素对食管鳞癌细胞系EC9706的mTOR/p70S6K信号通路的影响

目的：观察雷帕霉素（rapamycin，rapa）对食管鳞癌细胞系EC9706的mTOR／p70S6K信号通路的影响。方法：采用免疫细胞化学证实mTOR／p70S6K信号通路的存在，然后通过DNALadder、RT—PCR、Westernblot及流式细胞术分别从DNA、RNA、蛋白及细胞水平研究rapa对细胞凋亡和信号通路的影响。结果：免疫细胞化学结果显示，在细胞核及细胞质中mTOR均呈阳性；rapa处理后有明显DNALadder产生，且mTOR的mRNA水平及蛋白水平下调。但是，mTOR下游的直接靶点p70S6K的mRNA水平及蛋白水平则升高，二者的变化程度均与rapa剂量的相关；流式细胞术检测结果表明，rapa可使细胞停滞于G1期。结论：食管鳞癌细胞系EC9706中存在mTOR／p70S6K信号通路并且处于激活状态，rapa能明显促进细胞凋亡并抑制该通路激活，从而间接抑制翻译的进行。     

AIF的蛋白水平下调可减少TAp63γ诱导的细胞凋亡

目的：探讨凋亡诱导因子（AIF）在TAp63γ诱导细胞凋亡中的作用。方法：将质粒pcDNA3．1-TAp63γ转入人食管鳞癌EC9706细胞，抽提细胞DNA检测细胞是否凋亡，流式细胞仪检测凋亡率，并用亚细胞器分离技术分析AIF的转位；利用化学合成及基因重组技术构建AIF发夹状RNA表达载体，western blot检测干扰效果并用流式细胞仪分析凋亡率的变化。结果：pcDNA3．1-TAp63γ转染细胞24h后出现DNA ladder，凋亡率为13．64％，并在pcDNA3．1-TAp631转染组中细胞质和细胞核蛋白中检测到AIF；而空载体转染组则无DNA ladder，凋亡率为1．37％，且此组的细胞质和细胞核蛋白尤其是核蛋白内无AIF信号。成功构建表达发夹状AIF—siRNA的载体，其干扰效率约为80％。转染pcDNA3．1．TAp63γ 24h后，AIF—siRNA组的凋亡率是4．52％。结论：TAp63γ基因表达可诱导EC9706细胞凋亡；下调AIF的蛋白表达水平可降低TAp63γ诱导的细胞凋亡。     

杜氏盐藻荧光素酶基因表达载体的构建

目的：构建盐藻荧光素酶基因表达载体。方法：分别用合适的限制性内切酶消化载体pGL3-Enhancer vector、pD—B、pMD—CA和pMD—rbcS,胶回收适当的片段,T4 DNA连接酶过夜连接,转化宿主菌大肠杆菌JM109。挑取阳性克隆,提取质粒DNA,酶切鉴定。结果：得到含盐藻自身启动子碳酸酐酶(CA)基因启动子、双倍重复碳酸酐酶(DCA)基因启动子和来自衣藻的1,5二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶小亚基(rbcS)基因启动子,以及荧光素酶(Luc)基因为外源基因的3个盐藻表达载体。结论：构建了3个杜氏盐藻荧光素酶表达载体。     

EC9706和Eca109细胞中雷帕霉素靶蛋白信号通路激活状态观察

目的:观察低分化的食管鳞癌细胞EC9706和高分化的食管鳞癌细胞Eca109中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号转导通路的激活状态.方法:采用细胞免疫组织化学方法检测EC9706和Eca109细胞中mTOR及其下游靶分子p70S6K的表达和定位,并采用RT-PCR和Western blot方法分别从mRNA及蛋白水平检测此通路的活性.结果:在2种细胞中mTOR均有表达,且在EC9706细胞中的表达水平高于Eca109(P＜0.05);EC9706细胞中mTOR下游靶点的磷酸化水平高于Eca109细胞(P＜0.05).结论:在2种食管鳞癌细胞中,mTOR信号通路均特异性激活;但激活状态与细胞的分化程度有关,细胞分化程度低者通路的激活水平较高.     

雷帕霉素对食管鳞癌裸鼠移植瘤生长及mTOR/p70S6K信号通路的影响

目的:探讨雷帕霉素(rapamycin, RAPA)对荷人食管鳞癌裸鼠移植瘤生长及mTOR/p70S6K信号通路的影响.方法:建立人食管鳞癌细胞株EC9706的裸鼠移植瘤模型,观察经RAPA和RAPA联合顺铂治疗后荷瘤裸鼠的肿瘤生长情况;应用TUNEL、RT-PCR及Western 印迹法观察肿瘤组织中的细胞凋亡、mTOR和p70S6K mRNA以及mTOR、p70S6K和p-p70S6K的蛋白表达.结果:RAPA和顺铂均使肿瘤生长速度减慢(P<0.05),并且2者联合应用效果更好(P<0.01);TUNEL检测发现,RAPA在体内能引起EC9706细胞的凋亡(P<0.05);RT-PCR和Western 印迹法检测结果表明,RAPA在体内降低了mTOR、p70S6K mRNA和mTOR、p-p70S6K的蛋白表达,但可提高p70S6K的蛋白表达水平.结论:RAPA在体内通过抑制mTOR/p70S6K信号通路的活性促进细胞凋亡,从而抑制人食管鳞癌细胞EC9706裸鼠移植瘤的生长.     

人血管生成抑制因子canstatin原核表达载体的构建及表达

目的：构建国人血管生成抑制因子canstatin的原核表达载体并在大肠杆菌BL21中表达canstatin重组蛋白。方法：用Trizol试剂提取人肝脏组织总RNA,通过RT—PCR扩增canstatin的cDNA,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将canstatin cDNA定向克隆于原核表达载体pET30a( )中,而后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达。结果：canstatin cDNA克隆人质粒pET30a( )获得了重组表达载体pET30a( )／Cans,canstatin的cDNA长度为684bp．编码227个氨基酸。IPTG诱导原核表达载体pET30a( )／Cans在大肠杆菌BL21中的表达量约占菌体总蛋白量的35％。结论：原核表达载体pET30a( )／hCans存大肠杆菌BL21中高效表达canstatin重组蛋白。     

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白小分子干扰RNA对食管鳞癌细胞中mTOR-p70S6K信号通路及裸鼠移植瘤生长的影响

目的 检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)小分子干扰RNA(siRNA)对食管鳞癌中mTOR-p70S6K信号通路的阻断作用以及对裸鼠移植瘤生长的影响.方法 以食管鳞癌细胞株EC9706为研究对象,采用siRNA干扰、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、流式细胞术及CCK-8等方法,观察mTOR-p70S6K信号通路被阻断后,通路中各因子蛋白及mRNA表达的变化,及其对细胞增殖和凋亡的影响.进行裸鼠成瘤实验,观察mTOR siRNA对肿瘤生长的影响.结果 与未转染细胞相比,转染mTOR siRNA的细胞中mTOR和磷酸化p70S6K的表达水平降低(P<0.05),而pTOS6K的表达水平升高(P<0.05).转染mTOR siRNA后,细胞凋亡增加,细胞增殖能力降低,且对顺铂的敏感性增高,细胞被阻滞在G,期(P<0.05).mTOR siRNA能明显抑制裸鼠移植瘤的生长,siRNA组和siRNA+顺铂组的肿瘤抑制率分别为50.9%和62.3%.结论 mTOR siRNA能有效抑制mTOR-pTOS6K信号通路,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,在裸鼠体内能显著抑制肿瘤的生长.mTOR-pVOSSK信号通路在食管鳞癌发生发展中起重要作用.     

莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻中转录活性的检测

目的：验证莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的转录活性。方法：以绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)为报告基因,将报告基因插入莱茵衣藻叶绿体atpA启动子与rbcL终止子之间,构建载体pSP71-atpA—EGFP,用基因枪法转入杜氏盐藻叶绿体中,通过荧光显微镜观察EGFP基因在atpA启动子控制下的表达,以验证atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性。结果：荧光显微镜下观察到：EGFP在杜氏盐藻叶绿体中得到了表达。结论：莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中有转录起始活性,可以应用于杜氏盐藻的叶绿体转化。     

地高辛对小鼠吗啡行为敏化的影响

目的:探讨地高辛对小鼠吗啡行为敏化的影响.方法:测定小鼠的自主活动,观察地高辛对小鼠自主活动的影响.急性吗啡(10 mg·kg-1,ip)处理小鼠前给予地高辛,观察地高辛对急性吗啡引起小鼠高活动性的影响.慢性吗啡处理小鼠,建立吗啡行为敏化模型,观察地高辛对吗啡行为敏化的影响.结果:(1)地高辛(0.5 mg·kg-1-...