DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染BHK21细胞系的建立

目的 构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系.方法 以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,以Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切以及测序验证重组质粒的正确性.将重组质粒以Lipo-fectamine~(KM) 2000转染到BHK21细胞,通过G418及有限稀释法进行阳性克隆的筛选,建立稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western blotting及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达.结果 双酶切鉴定证明DC-SIGN基因已经成功克隆入真核表达载体pIRES-neo中,测序结果表明EC-SIGN基因与原序列一致.pIRES-neo-DC-SIGN转染BHK21细胞后,获得了急定表达DC-SIGN分子的细胞系.流式细胞仪检测结果显示,阳性克隆中DC-SIGN分子的表达率为85.42%.免疫荧光结果显示,DC-SIGN分子主要表达于细胞膜表面.Western blotting能检测到DC-SIGN蛋白表达的特异条带.结论 成功构建了稳定、高效表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础.     

人前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建包含人前列腺干细胞抗原(PSCA)的原核表达质粒,并进行诱导表达、蛋白纯化及鉴定.方法 通过PCR扩增人PSCA基因片段,与过渡载体pGEM-T Easy连接后进行测序鉴定,鉴定正确后,将PSCA基因片段酶切并插入含有谷胱甘肽s-转移本科GST标签的原核表达载体pET42a,得到重组质粒pET42a-PSCA.将pET42a-PSCA转化大肠埃希菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达GST-PSCA融合蛋白,用Glutathione-Sepharose 4B柱对融合蛋白进行纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定.结果 PSCA基因的PCR产物大小与预期相符,测序结果与GenBank 中的PSCA序列一致.pET42a-PSCA原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE及Western blotting检测显示融合蛋白诱导表达成功,分子量大小约为43kD.结论 成功构建了人PSCA的原核表达质粒,能在BL21菌株中表达,且纯化后得到较高纯度的GST-PSCA融合蛋白,为后续抗前列腺癌基因疫苗研究奠定了基础.     

NMM抗肿瘤治疗性DNA疫苗中卡那霉素残留量检测方法的建立与验证

建立并验证检测NMM抗肿瘤DNA疫苗中卡那霉素残留量的方法。采用间接竞争ELISA方法检测卡那霉素残留量,采用四参数Logstic曲线进行回归分析,并对本方法的专属性、检测限、定量限、线性与范围、精密度、准确度、耐用性等进行验证,验证方法有效后对多批次样品进行检测。使用该方法检测卡那霉素残留量时,样品无需稀释,辅料、质粒DNA对卡那霉素的检测无干扰;本方法检测限为0.15 ng/mL;定量限为0.5 ng/mL;在0.5～40.5 ng/mL范围内线性关系良好,且符合四参数方程式：y=D+(A-D)/[1+(x/C)^B],R²≥0.999;在检测线性范围内加入不同浓度的卡那霉素对照溶液,回收率均值在95%～115%之间(n=12,RSD=6.20%);本方法重复性试验中卡那霉素含量RSD值为4.22%(n=6),中间精密度试验中DNA疫苗中卡那霉素含量RSD值为10.95%。本方法检测实验条件发生微小变动时(不同人员、不同批次试剂盒、不同酶标仪),对测定结果的影响在可接受范围内。应用该方法对7批样品中卡那霉素残留量进行检测,结果表明,每个人用...     

小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样结构域的原核表达、纯化及活性鉴定

目的获得小鼠血管内皮生长因子Ⅱ型受体（mVEGFR2）胞外1-4IgG 样结构域融合蛋白并验证其免疫原性及生物活
性。方法利用RT-PCR法从孕龄14 d的Balb/c小鼠胚胎组织中扩增mVEGFR2D1-4基因,测序正确后将其克隆至原核表达载
体pET-42a,构建重组质粒pET-42a-mVEGFR2D1-4。将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,
目的蛋白用Western blotting鉴定后,亲和层析法纯化融合蛋白,ELISA法检测纯化蛋白的抗原活性,并通过体外细胞培养检测
该融合蛋白对血管内皮生长因子（VEGF）促人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的阻断作用。结果测序结果证实成功扩增出目
的基因mVEGFR2D1-4;酶切和测序结果证实pET-42a-mVEGFR2D1-4 原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化
出大小与预期一致的蛋白;Western blotting 证实纯化的蛋白能与特异性抗体发生反应;ELISA 检测显示纯化后的
mVEGFR2D1-4融合蛋白具有免疫原性,并且体外细胞培养试验证实其能阻断VEGF对HUVEC的促增殖作用。结论成功获
得mVEGFR2D1-4/GST融合蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性及生物活性,为进一步研究以VEGFR2为靶点的抗肿瘤主动免
疫治疗奠定了基础。
     

电穿孔技术对DNA疫苗pVAX-tG250FcGB免疫效果的影响

目的探讨应用电穿孔技术对DNA 疫苗pVAX-tG250FcGB 免疫效果的影响。方法构建肾癌DNA 疫苗pVAXtG250FcGB,
通过体内电穿孔技术或普通肌肉注射途径,将DNA疫苗导入到BALB/c小鼠体内,探讨电穿孔免疫途径诱导抗原
特异性免疫应答的效果。结果电穿孔技术或普通肌肉注射均能在小鼠体内诱导出抗原特异性的体液免疫应答和细胞免疫应
答,电穿孔技术的免疫效果明显优于普通肌肉注射途径。结论电穿孔技术介导的DNA疫苗pVAX-tG250FcGB免疫具有较强
的诱导免疫应答的能力,是研究DNA疫苗pVAX-tG250FcGB免疫效果的一种有效途径。
     

4-1BB体外刺激的T淋巴细胞抑制小鼠黑色素瘤的作用

目的 探讨4—1BB体外刺激下小鼠T淋巴细胞的增殖情况及对小鼠黑色素瘤的抑瘤效果．方法：在IL-2＋CD3＋CD28基础上,增加4—1BB为刺激条件,体外培养经诱导的小鼠腹股沟淋巴结T细胞,MTT法检测其体外增殖率,并建立小鼠黑色素瘤实验模型,观察所诱导T淋巴细胞的抑瘤效果．结果：增加4—1BB后,T淋巴细胞的增殖率明显增加[（1．15±0．08）％协（0．57±0．06）％,P〈0．01],将所诱导的T淋巴细胞注入小鼠模型,其肺转移灶数目明显减少[（93±6）vs（151±22）,P〈0．01],生存率提高,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）．结论：4—1BB在体外可促进T淋巴细胞的增殖,并具有较强的抗黑色素瘤作用．     

结核疫苗研究进展

卡介苗(BCG)的免疫保护作用存在争议,多重耐药结核杆菌(MDR-TB)的出现,以及艾滋病(AIDS)的流行,导致结核病(TB)的发病率呈现回升趋势,给TB防治提出了新的挑战.因此,发展新的TB疫苗成为TB防治的迫切需要.本文综述结核疫苗研究的最新进展.     

噻托溴铵干粉剂吸入对急性加重期慢性阻塞性肺疾病患者肺部感染BODE指数的影响

目的研究噻托溴铵干粉剂吸入对急性加重期慢性阻塞性肺疾病(AECOPD)患者肺部感染BODE指数的影响。方法纳入解放军总医院第四医学中心2016年3月至2019年3月80例AECOPD患者作为研究对象,采用随机数字表法将患者分为观察组和对照组,每组40例。两组均行常规治疗,观察组加用噻托溴铵干粉剂。比较两组总体治疗效果,记录两组治疗前后BODE指数。出院随访半年,记录肺部感染发生率,分析BODE指数判断肺部感染的价值。结果观察组总有效率为97.5%,对照组为90%,两组总有效率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后两组FEV1%pred和6MWT较治疗前均显著升高,MMRC和BODE指数评分较治疗前均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗后观察组FEV1%pred和6MWT均高于对照组,MMRC和BODE指数评分均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。两组治疗前后BMI比较,差异无统计学意义[治疗前:(21.85±2.02)kg/m 2 vs.(21.76±2.21)kg/m 2;治疗后:(22.07±1.85)kg/m 2 vs.(22.13±1.97)kg/m 2,P>0.05]。观察组肺部感染发生率低于对照组,差异有统计学意义(5.00%vs.22.50%,P<0.05)。ROC分析显示,BODE指数判断肺部感染的AUC为0.733(β=0.086,95%CI:0.563~0.902,P=0.014)。结论噻托溴铵干粉吸入剂用于AECOPD患者有助于降低BODE指数水平,监测BODE指数有助于预测肺部感染,指导临床。     

恩度联合化疗治疗多种晚期恶性肿瘤的护理

<正>我科于2008年7月～2009年12月采用恩度联合化疗治疗32例晚期恶性肿瘤患者,经过精心护理,取得满意效果。现将护理体会报告如下。     

p53AIP1基因转染对PC-3M人前列腺癌细胞生物学特性的影响

目的观测p53调节的凋亡诱导蛋白1(p53AIP1)对PC-3M人前列腺癌细胞的增殖、细胞周期、凋亡、侵袭及迁移的影响。方法构建真核载体pDC316-p53AIP1,并进行双酶切及PCR鉴定。在LipofectamineTM2000介导下转染至体外培养的PC-3M人前列腺癌细胞系中,Western blot法检测其表达,CCK-8法检测PC-3M细胞增殖情况,流式细胞术分析PC-3M细胞周期变化和annexinV-FITC/PI结合流式细胞术凋亡情况,TranswellTM实验检测p53AIP1对细胞迁移及侵袭能力的影响。结果成功构建了pDC316-p53AIP1真核表达载体,重组质粒转染PC-3M细胞后,Western blot法检测p53AIP1在PC-3M细胞中有表达,CCK-8结果显示表达的p53AIP1能抑制PC-3M细胞增殖(P0.05),流式细胞术检测细胞周期阻滞在S/G2-M期(P0.05)且p53AIP1能促进PC-3M细胞凋亡,TranswellTM侵袭和迁移实验显示p53AIP1使细胞侵袭迁移能力均降低(P0.05)。结论p53AIP1抑制PC-3M细胞的周期、增殖、侵袭及迁移,并能促进其凋亡。