对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM-CSF基因转染

目的探讨小鼠粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(mGM-CSF)基因转导对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果.方法应用脂质体将含有mGM-CSF基因的真核表达载体转染B16小鼠黑色素瘤细胞,经G418加压筛选后,挑选表达mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞.观察转导或未转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞在Balb/c小鼠体内的肺转移.结果转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞可以稳定表达mGM-CSF,在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因的黑色素瘤细胞对照组,二者差异显著(n=5,125.8±34.3vs27.8±24.0,P<0.01).结论mGM-CSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的肺转移,提示GM-CSF具有治疗黑色素瘤的临床应用前景.     

小鼠树突状细胞的体外培养与鉴定

目的: 探索、优化体外诱导和扩增小鼠树突状细胞(DC)的方法,并进行形态学观察和生物学鉴定. 方法: 应用环磷酰胺200 mg/kg经尾静脉注射Balb/c小鼠,8 d后处死小鼠,常规培养脾细胞,第3日加入含有IL-4, GM-CSF细胞因子的条件培养液,第5日补加TNF-α,第8日制备标本进行相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察,并分别在培养第3, 5, 7日经流式细胞仪检测成熟细胞表面标志. 结果: 刺激培养细胞经相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察,具有典型的DC形态,流式细胞仪检测发现细胞表面表达CD11c, CD86, ⅠAb, H2D6标志物. 结论: 在小鼠脾脏细胞培养中加入IL-4, GM-CSF, TNF-α等刺激,可获得足量、较高纯度的DC,为DC的基础研究与临床应用奠定了基础.     

人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的表达及生物活性分析

目的构建携带人肿瘤坏死因子受体(TNFR)胞外区融合人IgG Fc片段的重组腺相关病毒载体(pAAV/hTNFR-Fc),并对融合蛋白hTNFR-Fc的表达和生物学活性进行鉴定。方法构建hTNFR-Fc融合基因重组腺相关病毒(AAV)载体,体外转染人胚肾HEK293T细胞,收集转染上清,以Western blot法检测目的蛋白的表达,应用L929细胞测定重组表达产物对人和大鼠TNF-α细胞毒中和活性,采用ELISA比较重组表达产物对人和大鼠TNF-α的结合活性。结果成功构建重组表达载体pAAV/hTNFR-Fc,在转染细胞上清中检测到目的蛋白hTNFR-Fc的表达,重组表达产物可有效结合人TNF-α并中和其L929细胞毒活性,并对大鼠TNF-α具有一定程度的结合和中和活性。结论成功构建了hTNFR-Fc融合基因,验证了其在AAV载体上的分泌性表达,并对其生物活性进行了鉴定,为进一步病毒包装和大鼠关节炎动物实验研究奠定了基础。     

不同方式递送质粒DNA诱导体内表达效果的实验研究

目的比较不同途径递送质粒DNA至Balb／c小鼠体内所诱导的报告基因表达效果。方法将编码荧光素酶（1uc3蛋白的重组质粒（pGL-3-CMV）或空载体质粒pGL-3-basic以肌肉注射或电脉冲方法将10μg或100μg上述质粒注入小鼠股四头肌,基因枪法以三枪接种质粒于小鼠腹部（2μg质粒DNA／4．5Mpa／枪）。于质粒注入后24～144h,检测小鼠体内的荧光素酶活性。结果肌肉注射10μg的小鼠未检测到荧光素酶的表达;肌肉注射100μg、电脉冲法递送10μg和100μg质粒的小鼠,接种后48h体内荧光素酶活性达到峰值,递送100μg的小鼠体内表达量明显高于10μg的小鼠。基因枪免疫小鼠在接种24h达到峰值。结论电脉冲和基因枪介导的基因递送方式基因表达水平远远高于传统注射方法,是基因疫苗免疫递送的可靠方法。     

乙肝治疗性可复制型DNA疫苗pSVK-HBVA高稳定宿主菌的筛选及其基础培养基的选择

目的为乙肝治疗性可复制型DNA疫苗质粒pSVK-HBVA筛选稳定性高,能多次传代的宿主菌,以满足中试工艺的要求,同时对该工程菌最适的基础发酵培养基进行选择。方法将质粒pSVK-HBVA分别转化几种不同的大肠杆菌感受态细胞并提取质粒,通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的形态结构,连续传代法对工程菌的稳定性进行检测;选取质粒含量最高和稳定性最好的工程菌作为原始种子,按照2010版《中国药典》要求建立工程菌的三级种子批,并对种子批进行鉴定。同时,从LB,TB,M9(甘油),M9(葡萄糖)4种培养基中为工程菌筛选质粒产量最高的基础发酵培养基。结果经过筛选发现,在以大肠杆菌XL10-Gold为宿主菌时,质粒pSVK-HBVA表现出了同常规质粒DNA类似的稳定性,转接传代30次也未发生重组或片段丢失,能满足后续中试工艺的要求,LB作为基础培养基能得到最高的质粒容积产率为5.5 mg/L。结论大肠杆菌XL10-Gold是一个更利于可复制型DNA疫苗质粒pSVK-HBVA扩增的宿主菌,该工程菌发酵的最佳基础培养基是LB培养基。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6的构建和鉴定

目的构建含人/鼠嵌合粘附分子CD44拼接变异体6(chimeric human and mouse CD44 splice variant 6,h/mCD44v6)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,并进行表达。方法通过PCR扩增h/mCD44v6的全基因cDNA,将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcD-NA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcD-NA3.1(+)-h/mCD44v6,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6细胞株中h/mCD44v6全段基因cDNA。结果经4轮PCR,成功扩增出h/mCD44v6的cD-NA全长基因,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,通过RT-PCR方法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达;建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6。结论成功克隆和构建了h/mCD44v6的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,为进一步研究h/mCD44v6的新功能和免疫治疗奠定了基础。     

以PSCA为靶点的前列腺癌免疫治疗的研究进展

免疫疗法在前列腺癌治疗领域倍受重视。而前列腺干细胞抗原具有高度组织特异性,在人正常前列腺及良、恶性病变组织中均有表达,尤其在激素非依赖性前列腺癌及转移灶中表达明显增高,是前列腺癌免疫治疗的理想靶抗原。本文就目前以该抗原为靶点的前列腺癌免疫治疗研究及临床试验作一综述。     

人CD28-Fc融合蛋白在真核细胞中的表达与纯化

目的建立稳定表达CD28-Ig融合蛋白系统,提供用于研究的CD28-Ig融合蛋白。方法构建高表达的真核细胞表达载体,利用FAD批准的、可用于生产人用重组蛋白药物的CHO细胞进行表达,MTX加压筛选出稳定表达的细胞株。蛋白A纯化获得电泳纯融合蛋白。结果经RT-PCR,SDS-PAGE及Western印迹鉴定,CHO细胞上清中纯化的蛋白是CD28与Ⅰg的融合蛋白,并获得纯度较高的融合蛋白。结论成功建立CD28-Ig融合蛋白表达体系,并获得稳定表达融合蛋白的细胞株,为T细胞活化第二信号系统的基础研究奠定了基础。     

β-hCG蛋白在大肠杆菌系统的表达、纯化及活性鉴定

目的 获得β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)融合蛋白β-hCG/GST并验证其抗原活性.方法 利用PCR法扩增β-hCG全长基因,将其克隆至原核表达载体pET-42a中,构建重组质粒pET-42a-β-hCG,将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,亲和层析法纯化融合蛋白,目的蛋白用Western blot法鉴定,ELISA检测纯化得到的融合蛋白的抗原活性.结果 测序结果证实成功扩增出目的基因β-hCG;酶切和测序结果证实pET-42a-β-hCG原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot法及ELISA检测证实纯化后的β-hCG/GST融合蛋白具有良好的免疫原性.结论 成功获得β-hCG/GST融合蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,为以β-hCG为靶位的抗肿瘤主动免疫治疗研究奠定了基础.     

HBV融合抗原真核表达载体pIRES-neo-HBAg的构建及表达

目的 构建HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,并验证其在293T细胞中的表达.方法 以含有HBV融合抗原的质粒pVAX1-HBV为模板,PCR扩增该融合基因.PCR产物经纯化后,将其克隆至载体pMD18-T中,构建pMD18-T-HBV质粒,经酶切和测序鉴定后,将其定向克隆入真核表达载体pIRES-neo,获得真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.将该重组表达质粒瞬时转染人293T细胞,采用Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术验证HBV融合抗原的表达.结果 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术结果显示融合抗原能够在293T细胞中表达.结论 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.