抗肾细胞癌异种化G250抗原基因疫苗的构建及真核表达

目的：构建含有人肾细胞癌特异性抗原G250主要T细胞表位区域、猴和鼠G250部分片段区域融合基因tG250的真核表达质粒,并在猴肾COS7细胞中表达。方法：通过基因合成和PCR技术构建人、猴和鼠G250区域融合基因tG250,将其插入含有人IgK链前导信号肽（sig）、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI-FC-GPI中;将重组质粒pCI-Fe-tG250-GPI转染COS7细胞,流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果：tG250融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pCl-Fc-tG250-GPI中;流式细胞仪和免疫荧光检测显示,重组质粒pCI-Fe-tG250-GPI在COS7细胞中得到很好的表达。结论：成功构建了重组质粒pCI-Fe-tG250-GPI,且在COS7细胞中可以有效表达,为以G250抗原为靶点基因疫苗的后续功能研究打下良好基础。     

真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ的构建和鉴定

目的构建恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基macacam ulattac horionicg onadotrophin β subunit,rmCGβ）基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,并了解该质粒能否在真核细胞中表达。方法通过PCR扩增rmCGβ的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcDNA3．1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16／pcDNA3．1（＋）-rmCGβ细胞株中rmCGβ全段基因cDNA。结果经4轮PCR,成功扩增出rmCGβ的cDNA全长基因,酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,通过RT-PCR方法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达。建立了稳定的细胞株B16／pcDNA3．1（＋）-rmCGβ。结论成功克隆和构建了rmCGβ的真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,为进一步研究rmCGβ的新功能和免疫治疗奠定了基础。     

抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及包装

0　引言　人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验 ,同时 ,逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法 [1 ] .迄今所掌握的研究资料表明 ,接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应 .因此 ,我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体 p L XSN,将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(s Fv- TNF-α)克隆至该载体 ,进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究 .1　材料和方法1.1　材料　分泌型抗肝癌单链…     

HBsAb靶向干扰素和IL-12双表达质粒pVAX-HBVE的构建与应用

目的构建能同时表达HBsAb靶向干扰素(dsFvα)和人白细胞介素12(hIL-12)的新型基因治疗质粒pVAX-HBVE。方法将pEE14.1-dsFvα质粒双酶切获得dsFvα片段,克隆入经同样双酶切后的载体pVAX-IRES-hIL-12 IRES序列的上游,构建重组表达质粒命名为pVAX-HBVE。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,ELISA检测目的基因表达;提取重组质粒pVAXHBVE,注射到乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转入1.3拷贝HBV全基因组的BALB/c小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果 pVAX-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pVAX-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够含有靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的双表达质粒,为慢性乙肝基因治疗提供新的策略。     

对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM-CSF基因转染

目的探讨小鼠粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(mGM-CSF)基因转导对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果.方法应用脂质体将含有mGM-CSF基因的真核表达载体转染B16小鼠黑色素瘤细胞,经G418加压筛选后,挑选表达mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞.观察转导或未转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞在Balb/c小鼠体内的肺转移.结果转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞可以稳定表达mGM-CSF,在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因的黑色素瘤细胞对照组,二者差异显著(n=5,125.8±34.3vs27.8±24.0,P<0.01).结论mGM-CSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的肺转移,提示GM-CSF具有治疗黑色素瘤的临床应用前景.     

绒毛膜促性腺激素免疫靶向治疗与细胞表面工程技术

人绒毛膜促性腺激素β亚基（human chorionic gonadotrophin β subunit，hCGβ亚基）除了在正常的妊娠滋养层细胞中分泌外，在许多恶性肿瘤细胞中也大量分泌，称为异位hCG（eetopic human churionic gonadotrophin，eetopie hCG）。异位hCG与恶性肿瘤发生、发展的关系受到人们关注，以异位hCG为靶抗原的肿瘤疫苗正成为肿瘤生物治疗新的研究热点。细胞表面工程技术的应用为免疫靶向治疗提供了更加广阔的空间。     

肿瘤放射治疗与免疫治疗联合应用的研究进展

放射治疗(radiation therapy ,RT)是一种重要的癌症局部治疗手段,免疫治疗是肿瘤全身系统性治疗方法之一,二者联合应用可以起到很好的协同抗肿瘤作用.本文将对RT与免疫治疗联合应用治疗肿瘤的研究进展进行综述.     

复制子荧光素酶表达质粒pSVK-luc的构建与应用

目的 为研究复制子DNA疫苗在生物活体内的表达情况,构建含有荧光素酶报告基因的复制子表达质粒pSVK-luc.方法 PCR扩增荧光素酶报告基因,克隆入DNA复制子载体pSVK,酶切鉴定和测序分析筛选阳性重组质粒pSVK-luc;化学法转染人胚肾293T细胞,流式细胞术和免疫荧光法检测荧光素酶基因在293T细胞中的表达;利用基因电穿孔导入仪递送重组质粒至BALB/c小鼠股四头肌,活体成像仪动态观测荧光素酶基因在小鼠体内的表达.结果 pSVK-luc经相应酶切和测序鉴定,与预期设计完全一致.流式细胞术和免疫荧光检测均可见荧光素酶基因表达;同时活体成像仪也能检测到该基因在小鼠体内的表达.结论 pSVK-luc表达质粒的构建成功将为复制子DNA疫苗体内作用机制研究和体内电穿孔递送条件的优化奠定实验基础.     

人端粒酶逆转录酶在肿瘤免疫治疗中的应用进展

2009年的诺贝尔生理学和医学奖颁发给了Elizabeth H.Blackburn,Carol W.Greider和Jack W.Szostak,以表彰他们对端粒酶（Telomerase）的发现作出的贡献。自从端粒酶被发现至今,研究人员每年都要进行数百次的实验来探究端粒酶的结构和功能,并将这些研究成果应用到生物医药领域。     

小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及抗原活性检测

摘要：目的RT-PCR扩增小鼠前列腺干细胞抗原（mPSCA）基因,构建原核表达质粒pET-42a-mPSCA,诱导mPSCA蛋白表达并
纯化,并检测mPSCA蛋白的抗原活性。方法利用RT-PCR的方法从小鼠前列腺癌细胞系RM-1细胞中扩增mPSCA基因,测序
正确后PCR的方法去掉mPSCA的信号肽序列将其克隆至原核表达载体pET-42a中构建重组载体pET-42a-mPSCA。将其转化
至大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,随后将表达的融合蛋白进行纯化。经SDS-PAGE分析后,Western blot检测纯化的蛋白,
将纯化蛋白进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价。结果测序结果证实成功扩增出全长mPSCA基因;酶切和测序
结果证实pET-42a-mPSCA原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot检测证
实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应;ELISA 检测显示纯化后的mPSCA抗原具有免疫原性。结论成功扩增出小鼠全长
PSCA基因,成功构建了mPSCA基因的原核表达载体,获得了纯化的mPSCA蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究
以PSCA为靶点的前列腺癌的免疫治疗奠定了基础。