Nestin特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选

目的构建人nestin基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制nestin基因表达对人黑色素瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法分别用30、50、80 nmol/L干扰或80 nmol/L对照siRNA转染人黑色素瘤细胞株UACC903,48 h后用免疫荧光、RT-PCR和Western-blot鉴定nestin基因表达并筛选有效的序列,用有效或对照组序列的正义链和反义链,通过酶切、连接、转化和筛选,获得长期下调人nestin基因表达的慢病毒载体,并包装慢病毒感染人UACC903细胞,免疫组化和Western-blot鉴定干扰有效,以此获取nestin表达下调的UACC903细胞株。结果重组质粒成功转化高感受态大肠杆菌,经XhoⅠ和HPAⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确。干扰组或对照组慢病毒感染UACC903细胞后与对照组比较,干扰组mRNA和蛋白表达明显降低。结论成功构建了针对人nestin基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制nestin基因的表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础。     

人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达

目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.     

VSD治疗32例骨科创伤感染的临床效果观察

目的：研究对骨科创伤感染患者进行封闭负压引流(VSD)的临床效果。方法选取2013年8月~2015年2月我院骨科创伤感染患者62例,按随机数字表法将其分成实验组32例,对照组30例,实验组应用VSD术治疗,对照组应用常规引流术治疗,对比两组疗效。结果实验组平均换药次数为(2.63±0.63)次,创面愈合时间为(20.21±5.32)d,住院时间为(24.32±6.32)d,住院费用为(8221.21±352.11)元,创伤感染治疗总有效率为100.0%,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论封闭负压引流治疗骨科创伤感染患者效果显著,值得临床进一步推广应用。     

LASIK术中实时测量角膜厚度的临床意义

目的探讨准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis,LASIK)术中A超测量角膜瓣下基质床厚度的临床指导意义。方法对89例(177眼)常规LASIK术中制作角膜瓣后A超测量瓣下基质床厚度,计划预留角膜剩余基质床厚300μm,推算出激光可切削量,依此为依据调整激光光区切削范围,使实际角膜切削量小于可切削量来实时指导手术。结果角膜瓣厚平均为(118.01±18.03)μm,平均切削角膜厚度(77.62±22.65)μm,平均剩余角膜基质床厚度(321.28±13.28)μm。术后第1天、1周、1个月、3个月平均视力分别为1.02±0.23、1.0±0.22、1.04±0.20、1.18±0.24;117眼高于术前BSCVA一行以上,5眼下降一行以上,术后三个月残存屈光度为 0.75D～-1.25D,平均(-0.06±0.37)D。选择6.5 mm和8.0 mm切削光区的有111眼(62.71%),选择6.0 mm和8.0 mm的有59眼(33.5%),选择6.0 mm的有4眼(2.26%)。分区切削3眼(1.69%)。结论LASIK术中实时监测角膜瓣下基质床厚度,推算出可供激光切削角膜量,避免了制作角膜瓣的误差引起的术后剩余角膜基质床厚度不足的问题,避免了手术的盲目性,最大程度上降低术后角膜膨隆的风险。     

单盲法观察气管拔管时脉搏氧饱和度的变化

0　前言　脉搏氧饱和度仪监测 ,在防止全麻术后拔管时发生低氧血症可能性具有重要意义 .但是在国内许多基层医院尤其是边远地区 ,由于限于条件 ,未把血氧的监测作为常规指标 ,而依然把血压、脉搏、通气量、意识、呛咳及咽反射等传统拔管指征作为依据 .其间低氧血症发生的危险性究竟如何 ,我们采用单盲法进行了调查 .1　对象和方法1.1　对象　选择上腹部手术患者 30 (男 2 2 ,女 8)例 ,年龄 33～ 6 1(平均 47)岁 ,体质量 (5 2± 10 ) kg,无心肺功能不全 ,ASA分级 - 级 .麻醉前用药安定 10 mg,阿托品 0 .5 mg im ;麻醉诱导用药为 :咪唑安…     

不同级别小鼠来源的骨髓细胞对制备优势DC2的影响

目的探索不同级别小鼠来源的骨髓细胞对体外制备优势DC2细胞的影响。方法取SPF级和健康普通级C57BL/6小鼠股、胫骨骨髓细胞及脾细胞,设细胞因子诱导的实验组、低浓度GM-CSF对照组、无外源细胞因子对照组及脾细胞组。骨髓细胞采用GM-CSF,IL-4,Flt3L和SCF的不同细胞因子浓度和组合体外培养诱导。脾细胞培养2d去除大部分淋巴细胞,第3天采用流式细胞术4色荧光标记法分析细胞表型,骨髓细胞诱导的各组同样于第3天采用流式细胞术分析细胞表型,比较不同级别小鼠骨髓细胞所诱导的DC2细胞的表型和比例。结果SPF来源的小鼠骨髓细胞诱导的各组第3d在CD11c+的DC细胞群中CD8α+DC2所占比例及不成熟DC2的比例均高于普通级小鼠,显示普通鼠来源的骨髓细胞更倾向于产生成熟的DC,不易诱导产生高比例的不成熟的DC2。对两种动物脾细胞DC2的分析结果表明,普通鼠脾脏中CD8α-MHCⅡ+的成熟DC1比例为75.58%,远远超过SPF鼠的30.60%。结论小鼠的微生物级别可影响耐受性DC的诱导效果,采用SPF级小鼠来源的骨髓细胞体外制备优势DC2细胞效果优于普通级鼠,原因可能与普通鼠接触微生物较多,免疫系统更易于产...     

高迁移率蛋白B1对血管平滑肌细胞迁移的影响及分子机制研究

目的：探讨高迁移率蛋白B1（HMGB1）对血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移的影响及 TLR4依赖的 TLR4／PI3K／Akt信号通路介导的分子机制。方法体外分离培养大鼠胸主动脉VSMCs ,采用不同浓度 HMGB1（0．1～1000．0 ng ／mL）处理,分为对照组（未经任何处理）、HMGB1组、HMGB1＋ TLR4 siRNA转染组、Control siRNA转染组和磷脂酰肌醇3‐激酶（PI3K）抑制剂（LY294002）干预组,观察各组细胞活性及 HMGB1对 VSMCs 迁移的影响;实时定量 RT‐PCR与 Western blot 分别检测TLR4、Akt、p‐Akt、PI3K mRNA和蛋白的表达;ELISA测定PI3K的活性。结果 HMGB1（0．1～1000．0 ng／mL）呈剂量依赖性促进VSMCs迁移（P＜ 0．05）;经细胞活性测定,HMGB1在使用的浓度范围内对 VSMCs未造成细胞毒性作用（P＜ 0．05）;HMGB1（100 ng／mL）处理的 VSMCs细胞组 PI3K 活性及 Akt磷酸化水平明显增加（P＜ 0．05）;经 TLR4 siRNA 转染发现, HMGB1引起的VSMCs迁移明显减弱（P＜0．05）,同样在PI3k抑制剂干预组,PI3K／Akt途径活化和HMGB1介导的VSMCs迁移也被明显抑制（P＜0．05）。结论 HMGB1呈剂量依赖性促进VSMCs迁移,TLR4依赖的 TLR4／PI3K／Akt信号通路参与了此过程,提示以TLR4依赖的PI3K／Akt途径为靶点,可为阻塞性血管疾病的治疗提供新思路。     

急性心肌梗死患者急诊介入治疗后早期运动试验的可行性研究

[目的]评价急性心肌梗死(AMI)患者行急诊介入治疗(PCI)后早期运动试验的安全性和可行性, 为制定个体化的治疗方案提供参考标准。[方法]观察组为AMI患者,急诊PCI术后(12±5)d进行平板运动试验,对照组为稳定型心绞痛患者行PCI治疗后(189±21)d常规术后随访运动试验。观察两组运动时间、心率变化、代谢当量、心电图变化、缺血症状及严重并发症等指标,并进行统计学分析。[结果]与对照组相比, 心梗组运动试验中最高心率较低[(131±19)vs(159±24)次／min,P<0．05)],运动时间相对较短[(6．5± 4．3)vs(8．5±3．4)min,P<0．05)],METS值较低[(5．4±1．3)vs(7．1±1．9),P<0．01)],出现症状者也较多(5 vs 1,P<0．05)。两组最大收缩压、ST段最大变化、心电图变化导联数、PCI血管对应导联出现心电图变化例数无明显差异。两组均未出现急性心力衰竭、新发SI段抬高、室颤、休克等严重并发症。[结论]AMI患者行急诊PCI治疗后,早期进行运动试验是安全和可行的,适合临床推广。     

解剖M型超声心动图对骨髓间充质干细胞移植前后心脏结构和功能的研究

目的:应用解剖M型超声心动图(AME)对猪急性心肌梗死(AMI)经骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗前后左心室结构、局部及整体功能进行评价.方法:采用经冠状动脉丝线堵塞法制作小型猪AMI动物模型,造模2周后,经皮冠状动脉行移植MSCs治疗,于造模前、移植前后检测左心室16节段室壁运动搏幅(Am),左心室舒张末期内径(...     

指动脉逆行岛状皮瓣改良重建回流的临床应用

目的：分析吻合静脉重建回流在指动脉逆行岛状皮瓣中的应用。方法：在指动脉逆行岛状皮瓣移植手术中改良应用静脉吻合重建回流的方式,将包含在皮瓣内的指侧方静脉与手指远端伤口的静脉断端端端吻合重建皮瓣的回流。结果：36例36指皮瓣全部成活,无回流障碍,皮瓣质地良好,无需二期整形。结论：指动脉逆行岛状皮瓣移植手术改良应用静脉吻合重建回流的术式具备临床应用价值。