人canstatin基因克隆及其重组蛋白的表达和纯化

目的 克隆人血管能抑素canstatin基因,构建其原核表达载体,表达并纯化出canstatin蛋白。方法 从人胎盘组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增出canstatin基因,克隆进质粒pUCm-T,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-22b( )相应位点,转化E.coli BL21,IPTG诱导蛋白表达。超声破碎菌体,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白。结果 从人胎盘组织中提取总RNA,显示3条清晰条带,分别对应28S,18S,5S,分光光度计法测得总RNA浓度为1．8g／L;RT-PCR扩增出与预期目的基因canstatin长度一致的cDNA片段;构建出克隆质粒pUCm-T／canstatin,基因测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致;构建出表达质粒pET-22b( )／canstatin,BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实构建正确;IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24kD左右出现新的蛋白表达条带,诱导后1h、2h、3h、4h表达蛋白占菌体总蛋白的百分比分别为18．2％、18．8％、23．0％和23．4％;诱导3h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,125、250mmol／L眯唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带。结论 成功克隆出canstatin基因,成功构建了其原核表达载体,并且成功表达、纯化出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础。     

携带幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗的构建

目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(ureB)基因重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。方法 抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术从基因组DNA扩增ureB基因,克隆入pucmT载体,检测ureB基因序列,经过酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定。重组载体pIRES-ureB转入减毒鼠伤寒沙门菌LB5000,抽提质粒,再次转入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES-ureB转染COS-7细胞,SDS-PAGE Western印迹法检测pIRES-ureB表达蛋白的免疫原性。结果 扩增出长约1700bp的ureB基因,测序结果表明扩增出的ureB基因与基因库Hp ureB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实ureB基因克隆人真核表达载体pIRES,并成功构建了Hp ureB基因的减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,重组核酸疫苗稳定,并且Westem印迹法检测到特异性的蛋白条带。结论 构建了具有免疫反应性的Hp UreB减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,为进一步探索其体内的免疫作用奠定了基础。     

幽门螺杆菌空泡毒素活性的体外观察

目的研究幽门螺杆菌(Hp)液体浓缩上清液对胃上皮细胞的空泡毒性作用,为进一步开展空泡变性细胞毒素(VacA)的纯化及探讨VacA的致病机制奠定基础。方法将Hp菌株液体培养上清液制成粗制VacA蛋白,粗制VacA经倍比稀释(1∶160～1∶2)后与胃癌SGC7901细胞共同孵育后观察胃癌细胞形态变化,同时观察1∶2及1∶5滴度组于0、2、4、8、16和24h时的空泡活性。采用中性红摄入法(NRU)评价空泡活性。结果1∶2及1∶5滴度组胃癌细胞于24h时空泡形成细胞达100%,空泡细胞比例随毒素滴度递减。孵育24h时粗制VacA产生空泡活性的最小剂量约为6μg,超过120μg可导致细胞死亡。当毒素滴度为1∶2时,孵育4h即产生明显空泡[550nm光吸收值(A550)=0.43±0.06],至16h达最高吸收值(A550=0.71±0.03),至24h时因细胞大量死亡,A550反而下降至0.06±0.04,与空白对照组的差异无显著性(P>0.05)。1∶5毒素滴度的时间曲线较1∶2滴度更恰当反映出空泡活性随孵育时间变化的特性。结论Hp液体培养上清浓缩液对胃癌细胞具有明显的空泡毒性作用,VacA导致的空泡毒性具有明显的浓度及时间依赖性,且易受多种因素的影响,适当的浓度及孵育时间是VacA致病机制研究过程中的关键因素。     

食管酸灌注对非糜烂性胃食管反流病患者食管内脏敏感性的影响

目的研究酸灌注刺激对非糜烂性胃食管反流病(NERD)患者食管内脏敏感性的影响,探讨内脏感觉异常在NERD发病机制中的作用.方法 10例正常健康自愿者和21例NERD患者参与试验;采用Synectics内脏刺激器/电子气压泵和带有低顺应性气囊及多个灌注式压力通道的导管给食管以快速时相性气球扩张性刺激和进行食管酸灌注;利用食道气囊扩张术检测受试者对食管气囊扩张的反应.结果酸灌注前NERD患者食管气囊扩张诱发的初始感觉阈值和最大耐受疼痛阈值均低于健康对照组(P＜0.01).酸灌注后NERD患者初始感觉阈值和最大耐受痛阈均比相应基线值降低(P=0.015);酸灌注后健康对照组初始感觉阈值比相应基线值明显降低(P＜0.05),但最大耐受痛阈值无显著变化.NERD患者酸灌注的最大耐受痛阈为(9.70±3.06)ml,显著低于健康志愿者的(22.10±4.91)ml(P＜0.01).食管生理盐水灌注对NERD组和健康对照组的各项内脏敏感性指标均无明显的影响.结论酸灌注致敏食管壁化学感受器可明显增加NERD患者对食道机械刺激的反应,提示酸敏感的化学感受器和压力敏感的机械感受器之间可协同作用共同促进食管内脏高敏感性的形成.     

急性实验性应激状态下大鼠胃粘膜NOS变化及与胃粘膜损伤的关系

目的：探讨躯体性心理性应激状态下大鼠胃粘膜ＮＯＳ变化及与胃粘膜损伤发生的关系。方法：采用高压恒流脉冲刺激器复制胃粘膜损伤模型,将９６只雄性ＳＤ大鼠随机分为３组：对照组（Ｃ）,规则光组（Ｒ）及不规则光组（Ｉ）,分光光度法检测ＮＯＳ活性和Ｎｉｌｓ Ｌａｍｂｅｃｔｈ法测定胃粘膜损伤指数,使用兔源大鼠ＮＯＳⅠ,ＮＯＳⅡ,ＮＯＳⅢ多抗,采用免疫组化方法研究ＮＯＳ的分布规律。结果：正常情况下ＮＯＳ活性平稳,心理性应激后,大鼠胃粘膜ＮＯＳ活性明显升高（Ｐ〈０．０５）;与对照组比较,Ｒ,Ｉ组胃粘膜损伤指数均较高,且Ｉ组较Ｒ组变化显著（Ｐ〈０．０５）;ＮＯＳⅠ,ＮＯＳⅢ在３组中均有表达,而ＮＯＳⅡ只在Ｒ,Ｉ组中表达,且其表达无明显差异（Ｐ〉０．０５）。结论：心理性应激程度愈高胃粘膜损伤愈严重,胃粘膜损伤程度及ＮＯＳ活性变化与心理     

大鼠孤束核在五羟色胺介导的胰腺外分泌中的作用

目的:探讨在五羟色胺(5-HT)介导的胰腺外分泌中,大鼠孤束核所起的作用,并进一步阐明与这些作用相关的神经物质. 方法:在十二指肠内恒流灌注0.86 mol/L NaCl、10-4mol/L 5-HT,然后对各处理组中不同的孤束核切面(孤束核嘴侧平面、中间平面、尾侧平面)进行c-Fos免疫组化、c-Fos- NK1-R双重免疫组化染色方法(免疫荧光-免疫酶学),同时计数其中c-Fos阳性细胞数,并行定量分析;另外每15min 收集胆胰混合液一次,测定胰液蛋白含量. 结果:在孤束核各平面,5-HT组、0.86 mol/L NaCl组内c-Fos阳性神经元数量均高于假手术组(P<0.01),且在孤束核尾侧平面5-HT组(22.00±1.80)明显高于0.86 mol/L NaCl组(18.5±1.7)(P<0.01),另外两组在孤束核内的c- Fos阳性表达密集区域内均有NK1-R表达,而假手术组则未见c-Fos与NK1-R很好的重叠.胰蛋白测定方面:与假手术组胰液蛋白相比,5-HT组以及0.86 mol/L NaCl组在实验进行60 min(灌注后15 min)至135 min均有明显升高, 有统计学意义(P<0.01);且5-HT组(29.6±1.4 mg/15 min) 与0.86 mol/L NaCl组(18.1±2.4 mg/15 min)相比较,胰蛋白含量增加更为明显(P<0.01). 结论:在5-HT介导的胰液蛋白分泌中,大鼠孤束核起着感知及整理信息的作用,且这种作用的发挥与P物质受体有关.     

应激状态下大鼠胃黏膜组织中内皮素-1A受体mRNA的表达及其意义

应激性溃疡(SU)是危重疾病的常见严重并发症,其发生机制尚不清楚。研究表明内源性缩血管因子内皮素(ET)-1与SU密切相关,而关于其受体表达在SU发生中作用的研究尚少。目的:探讨ET-1A受体(ETAR)mRNA表达在SU发生中的作用和意义。方法:以冷束缚应激(CRS)制备大鼠胃溃疡模型,应激前和应激1 h、3 h、6 h、9 h、12 h后分别采用放射免疫测定、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和斑点杂交等方法,动态检测血浆和胃黏膜组织中的ET-1和胃黏膜组织中的ETAR mRNA水平,同时检测胃黏膜血流量(GMBF)和溃疡指数(UI)等指标的变化情况。结果:与正常对照组相比,各应激组大鼠血浆和胃黏膜组织中的ET-1水平均显著升高(P<0.05),GMBF显著下降(P<0.01),UI显著增加(P<0.01);胃黏膜组织中的ET-1水平与UI呈显著正相关(r=0.98,P<0.01),与GMBF呈显著负相关(r=-0.89,P<0.05),而血浆ET-1水平与GMBF、UI相关性不显著(r=-0.61,0.43,P>0.05)。GMBF与UI呈显著负相关(r=-0.98,P<0.01)。RT-PCR和斑点杂交显示各应激组大鼠胃黏膜组织中ETAR mRNA的表达水平较正常对照组显著升高(P<0.01),并与胃黏膜组织中的ET-1水平和UI呈显著正相关(r=0.93,0.95,P<0.01)。结论:在CRS诱发大鼠急性胃黏膜损伤的过程中,胃黏膜组织可显著增加ET-1的合成分泌和ETAR mRNA的     

胰腺癌组织相关蛋白质分子的差异表达

目的用双向凝胶电泳的方法建立胰腺癌、癌旁组织和正常胰腺组织的蛋白质组二维图谱并分析差异蛋白质点.方法提取人正常胰腺组织、胰腺癌和癌旁组织总蛋白质,双向电泳分离蛋白,比较不同组织中蛋白质表达的差异.每份组织均重复电泳3次.结果在同一份组织的3张银染的凝胶蛋白质图谱上均可辨识1 000个左右的蛋白质点,蛋白质点在形状、位置和密度上一致,重复性好.在不同组织之间发现了22个明显差异的蛋白质点,初步确定了其等电点和分子量.正常胰腺组织有一个高表达的蛋白质点,癌和癌旁组织有21个高表达的蛋白质点.结论正常胰腺组织、胰腺癌、癌旁组织蛋白质组二维图谱存在明显的差异,部分差异蛋白质可能具有诊断应用价值.     

胃镜消毒模拟试验--清洗与消毒时间探讨

目的探讨胃镜清洗与消毒浸泡的有效时间.方法采用1μg/ml乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和浓度为3×108/ml的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌悬液均匀地涂布在胃镜的镜身、活检孔道、活检钳,对胃镜按常规进行清洗3min后分别在消毒3min、5min、10min,收集清洗前、清洗后及消毒后不同时间段的标本,测其HBsAg和致病菌.结果清洗前能检测出致病菌和HB-sAg,彻底清洗后测不出HBsAg但能检测到致病菌,用适滴(碱性活性戊二醛)浸泡3min后能杀灭致病菌及HBsAg.结论彻底清洗与在2%戊二醛液中浸泡3min能有效杀灭致病菌与HBsAg.