携带幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗的构建

目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(ureB)基因重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。方法 抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术从基因组DNA扩增ureB基因,克隆入pucmT载体,检测ureB基因序列,经过酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定。重组载体pIRES-ureB转入减毒鼠伤寒沙门菌LB5000,抽提质粒,再次转入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES-ureB转染COS-7细胞,SDS-PAGE Western印迹法检测pIRES-ureB表达蛋白的免疫原性。结果 扩增出长约1700bp的ureB基因,测序结果表明扩增出的ureB基因与基因库Hp ureB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实ureB基因克隆人真核表达载体pIRES,并成功构建了Hp ureB基因的减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,重组核酸疫苗稳定,并且Westem印迹法检测到特异性的蛋白条带。结论 构建了具有免疫反应性的Hp UreB减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,为进一步探索其体内的免疫作用奠定了基础。     

幽门螺杆菌空泡毒素活性的体外观察

目的研究幽门螺杆菌(Hp)液体浓缩上清液对胃上皮细胞的空泡毒性作用,为进一步开展空泡变性细胞毒素(VacA)的纯化及探讨VacA的致病机制奠定基础。方法将Hp菌株液体培养上清液制成粗制VacA蛋白,粗制VacA经倍比稀释(1∶160～1∶2)后与胃癌SGC7901细胞共同孵育后观察胃癌细胞形态变化,同时观察1∶2及1∶5滴度组于0、2、4、8、16和24h时的空泡活性。采用中性红摄入法(NRU)评价空泡活性。结果1∶2及1∶5滴度组胃癌细胞于24h时空泡形成细胞达100%,空泡细胞比例随毒素滴度递减。孵育24h时粗制VacA产生空泡活性的最小剂量约为6μg,超过120μg可导致细胞死亡。当毒素滴度为1∶2时,孵育4h即产生明显空泡[550nm光吸收值(A550)=0.43±0.06],至16h达最高吸收值(A550=0.71±0.03),至24h时因细胞大量死亡,A550反而下降至0.06±0.04,与空白对照组的差异无显著性(P>0.05)。1∶5毒素滴度的时间曲线较1∶2滴度更恰当反映出空泡活性随孵育时间变化的特性。结论Hp液体培养上清浓缩液对胃癌细胞具有明显的空泡毒性作用,VacA导致的空泡毒性具有明显的浓度及时间依赖性,且易受多种因素的影响,适当的浓度及孵育时间是VacA致病机制研究过程中的关键因素。     

急性实验性应激状态下大鼠胃粘膜NOS变化及与胃粘膜损伤的关系

目的：探讨躯体性心理性应激状态下大鼠胃粘膜ＮＯＳ变化及与胃粘膜损伤发生的关系。方法：采用高压恒流脉冲刺激器复制胃粘膜损伤模型,将９６只雄性ＳＤ大鼠随机分为３组：对照组（Ｃ）,规则光组（Ｒ）及不规则光组（Ｉ）,分光光度法检测ＮＯＳ活性和Ｎｉｌｓ Ｌａｍｂｅｃｔｈ法测定胃粘膜损伤指数,使用兔源大鼠ＮＯＳⅠ,ＮＯＳⅡ,ＮＯＳⅢ多抗,采用免疫组化方法研究ＮＯＳ的分布规律。结果：正常情况下ＮＯＳ活性平稳,心理性应激后,大鼠胃粘膜ＮＯＳ活性明显升高（Ｐ〈０．０５）;与对照组比较,Ｒ,Ｉ组胃粘膜损伤指数均较高,且Ｉ组较Ｒ组变化显著（Ｐ〈０．０５）;ＮＯＳⅠ,ＮＯＳⅢ在３组中均有表达,而ＮＯＳⅡ只在Ｒ,Ｉ组中表达,且其表达无明显差异（Ｐ〉０．０５）。结论：心理性应激程度愈高胃粘膜损伤愈严重,胃粘膜损伤程度及ＮＯＳ活性变化与心理     

cag致病岛在中国人感染幽门螺杆菌中的结构特征及分类价值

目的：探讨cag致病岛基因群在中国人感染的幽门螺杆菌（Hp）中结构特征及其与临床疾病的关系,以及根据cag致病岛结构对Hp进行分类的意义。方法：合成五对针对cagA、cag致病岛中的cagⅠ、cagⅡ、cagⅠ与cagⅡ连接处、及IS605等基因片段的引物,采用PCR方法分别检测临床分离培养的107株Hp基因中,cag致病岛及相关基因结构的存在状态。结果：cag致病岛总的阳性检出率为95．3%,其中cagA、cagⅠ、cagⅡ的阳性率分别为92．5％、86．9％、69．2％,在慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等不同疾病组间的检出率差异无显著性（P＞0．05）。IS605的阳性检出率为43．9％,在慢性胃炎中的检出率（52．2％）明显高于十二指肠溃疡中的检出率（13．6％,P＜0．05）;cagI与cagⅡ连接处（呈连续状态存在的cag致病岛）的检出率仅为4．7％。其在十二指肠溃疡中的检出率（14．8％）明显高于慢性胃炎（1．5％）等（P＜0．01）。cag致病岛阴性的Hp菌株主要来源于慢性胃炎。cagI总的检出率（86．9％）明显高于cag Ⅱ（69．2％）,差异在慢性胃炎中有显著性（P＜0．01）;另外,cagI部分片段缺失的中国Hp菌株,其中1株为仅有cagA存在、cagⅡ及cagI其它部分均缺失的Hp的IS605阳性扩增片段明显大于国外标准菌株及其它国内阳性菌株。结论：cag致病岛在中国人群感染Hp中的存在频率极高,其结构显示出一定的地域分布特征,并在中国Hp菌株中发现新的cag致病岛结构形式存在,cag致病岛结构的变化与临床疾病的发生有一定关系,可初步将Hp划分为不同毒力的细菌群。     

内镜下鼻胰管引流术临床应用初步研究

目的探讨内镜下鼻胰管引流术的置入方法及临床应用.方法内镜逆行胰胆管造影(ERCP)检查后置放鼻胰管并收集胰腺癌(12例)及慢性胰腺炎(8例)患者胰液20例.结果收集胰腺癌和慢性胰腺炎患者的胰液量分别为86m1±27ml(56～140m1)和102ml±24ml(73～150m1).胰腺癌患者的胰液细胞学阳性率为8.3%,其癌胚抗原(CEA)值(49.04ng/L±29.70 ng/L)明显高于慢性胰腺炎患者(18.84 ng/L±12.88 ng/L).结论ERCP下放置鼻胰管方法简单,可获取足量的胰液,并可预防ERCP术后高淀粉酶血症和胰腺炎.     

IS605在中国人感染幽门螺杆菌中的检出特征

为探讨一新的座子插入元件IS605在中国人群感染幽门杆蓖(Hp)现的相关性,作者采用PCR方法,在107例临床分离培养的Hp菌株中,扩增IS6 05中的1167bp片段。发现：IS605在中国人群感染Hp中的阳性检出率为43.9%,在十二指肠溃疡中的检出率13.6%,明显低于慢性胃炎（52.2%)等其它Hp相关疾病组中的检出率（P＜0.05)。说明：作为转卒子插入元件的IS605,在中国人慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等不同疾病来源的Hp中均有分布,其中十二指肠溃疡中的检出率明显低于慢性胃炎等其它Hp相关疾病中的检出率。提示IS605的出现,与Hp致十二指肠溃疡的毒力改变有关。     

幽门螺杆菌UreB核酸疫苗的构建

目的:构建含幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)基因的核酸疫苗.方法:抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用PCR技术从基因组DNA扩增UreB基因,克隆入PUCmT载体,检测UreB基因序列.经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定.通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES-UreB转染COS-7细胞,Western印迹分析检测pIRES-UreB表达UreB蛋白的免疫原性.结果:扩增出长约1 700 bp的UreB基因,与基因库Hp UreB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实成功构建了含UreB基因的Hp核酸疫苗pIRES-UreB,并且Western 印迹分析检测到特异性的蛋白条带.结论:构建了具有免疫反应性UreB基因的Hp核酸疫苗,为进一步探索其免疫作用奠定了基础.     

一氧化氮及血管活性肠肽在实验性反流性食管炎发病机制中的作用

目的：探讨一氧化氮（NO）及血管活性肠肽（VIP）在实验性反流性食管炎（RE）发病机制中的应用,方法：18只SD大鼠随机分为A、B、C3组,A、B两组手术造成RE,C组采用伪开腹术。2－3月时免疫组化法及彩色图像分析仪对3组大鼠食管组织中的NO及VIP含量进行定性。结果：A、B两组大鼠均发生RE,A组引起有溃疡的RE的比例比B组高。A、B两组大鼠食管壁各层组织中NO能和VIP能阳性神经和其阳性产物显著多于C组,A、B两组之间无明显差异。结论：单纯十二指肠液反流可引起RE,其致炎作用可能较混合反流要强,实验性RE大鼠食管组织中NO组、VIP能阳性神经显著增加,提示NO能和VIP能阳性神经在RE的发生机制中起了 重要的作用。     

食管酸灌注对非糜烂性胃食管反流病患者食管内脏敏感性的影响

目的研究酸灌注刺激对非糜烂性胃食管反流病(NERD)患者食管内脏敏感性的影响,探讨内脏感觉异常在NERD发病机制中的作用.方法 10例正常健康自愿者和21例NERD患者参与试验;采用Synectics内脏刺激器/电子气压泵和带有低顺应性气囊及多个灌注式压力通道的导管给食管以快速时相性气球扩张性刺激和进行食管酸灌注;利用食道气囊扩张术检测受试者对食管气囊扩张的反应.结果酸灌注前NERD患者食管气囊扩张诱发的初始感觉阈值和最大耐受疼痛阈值均低于健康对照组(P＜0.01).酸灌注后NERD患者初始感觉阈值和最大耐受痛阈均比相应基线值降低(P=0.015);酸灌注后健康对照组初始感觉阈值比相应基线值明显降低(P＜0.05),但最大耐受痛阈值无显著变化.NERD患者酸灌注的最大耐受痛阈为(9.70±3.06)ml,显著低于健康志愿者的(22.10±4.91)ml(P＜0.01).食管生理盐水灌注对NERD组和健康对照组的各项内脏敏感性指标均无明显的影响.结论酸灌注致敏食管壁化学感受器可明显增加NERD患者对食道机械刺激的反应,提示酸敏感的化学感受器和压力敏感的机械感受器之间可协同作用共同促进食管内脏高敏感性的形成.     

胃镜消毒模拟试验--清洗与消毒时间探讨

目的探讨胃镜清洗与消毒浸泡的有效时间.方法采用1μg/ml乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和浓度为3×108/ml的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌悬液均匀地涂布在胃镜的镜身、活检孔道、活检钳,对胃镜按常规进行清洗3min后分别在消毒3min、5min、10min,收集清洗前、清洗后及消毒后不同时间段的标本,测其HBsAg和致病菌.结果清洗前能检测出致病菌和HB-sAg,彻底清洗后测不出HBsAg但能检测到致病菌,用适滴(碱性活性戊二醛)浸泡3min后能杀灭致病菌及HBsAg.结论彻底清洗与在2%戊二醛液中浸泡3min能有效杀灭致病菌与HBsAg.