无嘌呤嘧啶核酸内切酶在胰腺癌组织的表达及其临床意义

目的研究胰腺癌组织APE的表达及其与临床肿瘤指标的关系.方法 (1)通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测4株胰腺癌细胞株APE mRNA的表达;(2)收集37例手术切除的胰腺癌及12例相应癌旁胰腺组织石蜡标本,应用EnVision免疫组化法分别检测癌组织和癌旁胰腺组织APE的表达情况.结果 4株胰腺癌细胞株均有APE mRNA表达;37例胰腺癌中APE阳性表达33例(89.2%),其中APE胞核阳性表达7例(21.2%),胞质阳性表达5例(15.2%),胞质及胞核均表达21例(63.6%).12例癌旁胰腺组织导管及腺泡呈阴性表达,胰岛胞质呈阳性表达,胰腺上皮内瘤变呈胞核阳性表达.APE阳性率与肿瘤分化程度,肿瘤大小、淋巴及远处转移无关(P ＞ 0.1).结论 APE在胰腺癌组织中有较高的阳性表达率,检测其定位的特异性表达可能有助于胰腺癌的早期诊断.     

以白细胞介素-2为免疫佐剂的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的构建及其免疫保护作用

背景：细胞因子具有免疫佐剂效应，但将其用作幽门螺杆菌（H．pylori）核酸疫苗佐剂的研究报道尚少。目的：构建同时含H．pylori尿素酶B亚单位（ureB）基因和小鼠白细胞介素-2（IL-2）基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗，体外鉴定其表达蛋白的免疫原性，体内检测其对H．priori感染的免疫保护作用。方法：以聚合酶链反应（PCR）扩增H．priori ureB基因和小鼠IL-2基因，分别插入pUCmT载体，测序，通过一系列酶切、连接反应分别克隆人真核表达载体pIRES，酶切、PCR鉴定；重组质粒pIRES-ureB和pIRES-ureB-IL-2分别转化减毒鼠伤寒沙门菌LB5000，抽提质粒，进一步转化终宿主菌SL7207，反复传代培养。以Lipofectamine^TM2000将重组质粒分别体外转染COS-7细胞，蛋白质印迹法检测表达蛋白的免疫原性。以疫苗菌经口接种小鼠，4周后予H．pylori攻击，攻击后4周鉴定H．pylori感染状况。结果：测序结果显示扩增出的ureB和IL-2基因序列与GenBank中的H．pylori ureB和小鼠IL-2序列一致，酶切、PCR鉴定证实ureB和IL-2基因已克隆人pIRES载体，并成功构建了稳定的含H．pylori ureB和小鼠IL-2基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。蛋白质印迹法显示，pIRES-ureB-IL-2转染的COS-7细胞表达特异性UreB和IL-2蛋白。体内实验显示，疫苗接种组小鼠的免疫保护率显著高于PBS对照组（P〈0．01），其中ureB-IL-2疫苗组又显著高于ureB疫苗组（87．5％对62．5％，P〈0．05）。结论：成功构建了编码H．pylori ureB和免疫佐剂IL-2基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗，体外实验证实其可表达具有免疫原性的抗原蛋白和佐剂蛋白，体内实验证实其对小鼠H．pylori感染具有免疫保护性，免疫佐剂IL-2可提高核酸疫苗的免疫保护率。     

健择对胰腺癌细胞株蛋白质表达的影响

目的观察健择致胰腺癌细胞株蛋白质变化的影响,寻找一些在化疗过程中出现的蛋白质,为临床治疗提供理论依据.方法利用蛋白质组学技术,分析胰腺癌细胞株SW-1990在加入健择和5-FU后其蛋白质谱的变化,最后鉴定其差异表达的蛋白质.结果培养细胞受抑制约50%时,健择为1～100 ng/ml,5-FU为250～2 500 ng/ml.质谱鉴定了9个差异表达的蛋白质,其中对照组3个,加药组6个.结论健择对细胞株的作用明显优于5-FU.β-肌动蛋白、MGC:19713等某些高表达的蛋白质可能成为观察化疗效果的重要指标.     

血管紧张素Ⅱ诱导胰腺星状细胞炎性活化的分子机制研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ对大鼠胰星状细胞（PSC）核因子κB（NF-κB）信号转导通路活化的影响.方法采用电泳迁移率改变分析（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）检测细胞NF-κB的DNA结合活性,Western印迹方法检测NF-κB抑制蛋白（IκBs）降解.单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因和蛋白表达分别采用Northern印迹和ELISA方法检测.结果血管紧张素Ⅱ可诱导大鼠PSC内NF-κB发生双相活化,活化高峰分别出现在15 min和6 h后.NF-κB活化伴有IκBα和IκB β联合降解.抗氧化剂吡咯烷二硫基甲酸盐（PDTC）、二碘基苯（DPI）和N-乙酰丝氨酸可明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导的NF-κB活化,提示氧化应激反应在NF-κB活化中发挥了重要作用.NF-κB抑制剂MG132和PDTC可显著下调血管紧张素诱导的MCP-1基因表达.结论血管紧张素Ⅱ可通过氧化应激机制活化PSC内NF-κB信号通路,诱导MCP-1表达,从而参与胰腺炎症和纤维化的发生.     

重症急性胰腺炎大鼠丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路的动态变化

目的：阐明重症急性胰腺炎时大鼠胰腺及肺脏组织丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的变化规律。方法：以胰胆管逆行注射5％牛磺胆酸钠建立大鼠重症急性胰腺炎(SAP)模型，将SD大鼠56只随机分为对照组(即造模前)、造模后0．5、1、3、6、12和24h共7组，采用Western blot法检测胰腺及肺脏组织p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)活性变化。结果：对照组能检测到p38MAPK的基础活性，而检测不到JNK活性。造模后，胰腺组织的p38MAPK活性明显增高，至3h达到高峰，而肺脏组织的p38MAPK活性在6h达到高峰，两者在24h点处的p38MAPK活性仍高于基础值，而JNK的活性仅在12h点处有增高，24h点已检测不到JNK活性。结论：MAPK信号转导通路，特别是p38MAPK是重症急性胰腺炎发病过程中的重要信号转导通路。     

人胰腺癌Hedgehog信号通路中膜蛋白受体PTCH的纯化

目的 构建人胰腺癌PTCH基因表达载体并诱导融合蛋白表达。方法 从人胰腺癌细胞株SW1990抽提总RNA，经RT—PCR扩增出PTCH基因，经纯化、回收目的基因PTCH，将其插入表达载体pET22b，转化E．Coli BL21-CodonPlus^（TM）-RP，构建重组质粒pET22b／PTCH，IPTG诱导表达融合蛋白，免疫印迹进行鉴定，Ni-螯合亲和层析纯化融合蛋白。结果 从人胰腺癌细胞株SW1990克隆出长为789bp PTCH目的片段，成功构建重组质粒pET22b／PTCH，并诱导表达目的蛋白；经Ni-螯合亲和层析得到纯化的融合蛋白。结论 成功构建了重组质粒pET22b／PTCH，并获得纯化的融合蛋白，为进一步研究Hedgehog信号通路在胰腺癌中的发病机制提供了有效工具。     

Sonic hedgehog蛋白N端基因片段毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建含Sonic hedgehog(SHH)蛋白N端基因片段的毕赤酵母表达载体.方法 通过BamH 1、Xho 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N基因片段插入pET22b原核表达载体,构建pET22b-SHH-N质粒;经PCR扩增,产物再与pTA2载体连接,构建pTA2-SHH-N重组质粒;经EcoR 1及Not 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N端基因片段插入pPIC9K质粒,构建pPIC9K-SHH-N重组质粒;通过线性化、脱磷酸化,将线性化pPIC9 K-SHH-N DNA转染毕赤酵母菌株GS115,最后经PCR扩增和测序鉴定.结果 转染的毕赤酵母经PCR扩增和测序证实含有SHH-N基因片段,与原始的基因片段序列完全一致.结论 成功地构建含SHH-N蛋白基因片段的毕赤酵母表达载体.     

水浸束缚应激大鼠胃壁细胞形态和泌酸功能的研究

背景:应激性溃疡(SU)是临床危重疾病的常见并发症,通常认为胃黏膜缺血是SU的主要发病机制,而胃酸则在此基础上起重要作用,但胃酸在SU发病中的确切作用尚未完全阐明.目的:研究水浸束缚应激(WRS)大鼠胃壁细胞形态和泌酸功能的变化,以进一步阐明胃酸在SU发病中的作用.方法:将15只Sprague-Dawley大鼠随机分为WRS2 h组、WRS 4 h组和正常对照组,予相应处理后测定胃液pH值,处死大鼠,评估胃黏膜溃疡指数(UI),以免疫荧光技术标记H /K -ATP酶后用激光共聚焦扫描显微镜观察壁细胞形态并进行分类和计数.分析胃液pH值与胃黏膜UI和分泌期壁细胞数之间的关系.结果:WRS 2 h组和WRS 4 h组的胃液pH值均较正常对照组显著降低(P＜0.01),两组WRS组之间则无显著差异.WRS 2 h组和WRS 4 h组的胃黏膜UI和分泌期壁细胞(网格样细胞)数均显著高于正常对照组(P＜0.01),其中WRS 4 h组显著高于WRS 2 h组(P＜0.01).正常对照组的胃液pH值与分泌期壁细胞数呈负相关(r＝-0.81,P＜0.05),WRS组的胃液pH值与胃黏膜UI和分泌期壁细胞数均呈负相关(r=-0.85,P＜0.05;r=-0.89,P＜0.05).结论:WRS大鼠的胃酸分泌与胃黏膜UI和分泌期壁细胞数呈正相关,从细胞学水平证明胃酸增高在SU的形成中起重要作用.     

以白细胞介素-2为免疫佐剂的幽门螺杆菌粘附素核酸疫苗制备及其免疫预防作用

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）粘附素（HpaA）基因和白细胞介素（IL）-2的核酸疫苗，体外转染COS-7细胞，鉴定其表达蛋白的免疫原性和免疫保护作用。方法应用聚合酶链反应（PCR）技术从Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA扩增HpaA基因；从重组质粒pCIneo—IL-2扩增小鼠IL-2基因，并通过TA克隆分别克隆人pUCmT载体。检测HpaA及IL-2的核苷酸序列，酶切、连接反应将HpaA和IL-2同时克隆人真核表达载体pIRES，再经PCR法和酶切反应进行鉴定；通过脂质体法将重组载体pIRES-HpaA—IL-2转染COS-7细胞，SDS-PAGE及Western印迹法检测表达蛋白的免疫原性。重组载体转化减毒鼠伤寒沙门菌LB5000，抽提质粒，转化人SL7207，反复传代，鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。以该疫苗菌经口接种小鼠，4周后再用Hp攻击，鉴定感染状况。结果测序结果证实扩增的HpaA基因与HpHpaA序列一致，IL-2序列和小鼠IL-2序列一致。PCR和酶切鉴定结果证实，HpaA和IL-2基因克隆人载体pIRES，成功构建含HpaA和IL-2基因的核酸疫苗质粒pIRES-HpaA—IL-2，Western印迹法检测到相对分子质量分别为30000和14000的HpaA和IL-2蛋白条带。小鼠体内实验显示HpaA—IL-2及HpaA组分别有75．0％、58．4％获免疫保护，与PBS组差异有统计学意义（P〈0．01）。结论成功构建了HpaA和IL-2的Hp减毒沙门核酸疫苗菌，其免疫原性和保护性均得到证实，免疫佐剂IL-2可提高免疫保护率。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白核酸疫苗实验研究

目的 构建幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(Hp-NAP)口服DNA疫苗，初步评价其免疫治疗作用，为Hp疫苗研制奠定基础。方法 PCR扩增全长Hp-NAP基因(napA)，测序并同源性分析后，亚克隆入真核表达载体pIRES，双酶切并PCR鉴定。将重组质粒plRES-napA转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207，口服接种长期感染Hp之BALB／c小鼠，观察疗效。结果PCR扩增出-435bp产物，序列分析表明，所克隆序列与CenBank中SSl-napA核苷酸及蛋白质同源性均＞98％。PCR及双酶切证实，成功构建了携带napA的重组减毒鼠伤寒沙门菌DNA疫苗。疫苗接种后4周，治疗组3／4小鼠快速尿素酶检测阴性，对照组均阳性(P=0．0476)；治疗组血清抗Hp-NAP抗体效价明显升高。结论 成功构建了具有较好免疫治疗作用的Hp—NAP口服重组DNA疫苗，为进一步研制多价抗HpDNA疫苗奠定了基础。