胰腺癌细胞株Pc-3、HS766T DPC4基因的表达检测及其对细胞增殖的影响初探

目的：了解Pc-3、HS766T两个胰腺癌细胞株DPC4基因的表达情况。方法：用Trizol试剂提取两个细胞株培养细胞的总RNA,用RT-PCR的方法合成DPC4的cDNA并经与标准cDNA电泳确认后,用Qiagen PCR纯外试剂盒纯化,将纯化的cDNA与克隆载体P1-Adv连接,并用连接产物转化大肠杆菌,扩增后提取质粒,经酶切鉴定后,送上海博亚公司测序,并上网与基因库中DPC4的cDNA比较,同时观察两个细胞株肿瘤细胞的生长情况。结果：HS766T细胞无DPC4基因表达(同源缺失),Pc-3细胞存在DPC4基因表达,但其cDNA片段与理论值相比．短约200bp,上网BLAST的结果表明,在中间连接区,有一236bp的片段缺失。两个细胞生长观察表明,Pc-3细胞生长明显慢于HS766T。结论：胰腺癌细胞株HS766T中DPC4基因同源缺失,细胞具有生长快速的特点。胰腺癌细胞株Pc-3中有正常功能的DPC4表达．但该DPC4转录产物显示,在其连接区有-236bp的片段缺失。该片段缺失对DPC4功能的具体影响尚不明确。     

钙通道活性与胃泌素促人结肠癌细胞增殖间关系的研究

目的 :探讨钙通道活性在胃泌素促人结肠癌细胞增殖中的作用。方法 :运用流式细胞仪检测细胞内游离钙离子水平 ,MTT比色法测定细胞增殖情况。结果 :2 5× 10 -6M的五肽胃泌素 (PG)可以引起HT2 9细胞内游离钙离子水平明显升高 (P <0 0 1) ,钙通道阻滞剂nifedipine (10 -5M)可以使PG引起的钙离子水平升高幅度明显下降 (P <0 0 1)。同时可以部分抑制PG促增殖作用 (P <0 0 5 )。钙通道激动剂Bayk86 44 (10 -6M)可以明显升高细胞内钙离子水平 (P <0 0 1)。并能促进HT2 9细胞增殖 (P <0 0 5 ) ,与PG的促增殖作用相比无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论 :钙通道作为调节细胞内钙离子变化的主要途径 ,在调控PG促HT2 9细胞增殖中具有重要作用     

果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体cDNA克隆及其载体的构建

目的克隆果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体(FGFR-1)全长基因序列,构建其真核表达载体pdFR1。方法采用PCR方法扩增果蝇FGFR-1基因全长序列,克隆人载体pT—Adv,转化大肠杆菌XL1-Blue,挑选白色菌落行酶切鉴定及测序。重组质粒pT—Adv／FGFR-1酶切,回收目的基因片段,将其克隆人真核表达载体pcDNA3．1( )中,命名为pdFR1,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pT-Adv／FGFR-1测序结果与GenBank完全一致,pdFR1行限制性内切酶酶切,酶切片段与预期值相符。结论克隆了果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体全长基因序列,构建了其真核表达载体pdFR1,为完善异种分子疫苗免疫理论莫定基础。     

表达人CD40配体的重组腺病毒载体的构建

目的　构建含有hCD40L基因的重组腺病毒载体,为其在动物模型体内表达和肿瘤基因治疗提供基础。方法　用XhoⅠ、SwaⅠ双酶切质粒pORF-hCD40L,回收1 900 bp基因片段并定向克隆插入穿梭质粒pShuttle中 XhoⅠ、EcoRⅤ双酶切位点,得到重组质粒pShuttle-hCD40L。经PmeI酶切与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化 BJ5183细菌,同源重组后用选择培养基筛选阳性克隆,提取质粒PacI酶切线性化后用脂质体介导转染293细胞。酶切分析和PCR鉴定重组的腺病毒。结果　酶切分析、PCR验证表明,hCD40L基因成功克隆到腺病毒pAdEasy-1 载体中。结论　成功构建表达hCD40L基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其在哺乳动物内表达及基因治疗提供了基础。     

人EGFR胞外段原核表达及免疫原性研究

目的：研究人EGFR胞外段在原核本质的表达，纯化条件以及对小鼠的免疫原性。方法：以既往构建包含人EGFR胞外段基因的表达质粒为基础，采用基因工程方法构建pET原核表达载体。在大肠杆菌中表达目的蛋白，表达蛋白在变性条件下，通过Ni^2 柱亲和层析纯化以包涵体形式存在的His-Tag融合蛋白，SDS－PAGE检测其纯度。去余His-Tag的纯化蛋白在梯度尿素中透析复性。以复性蛋白免疫小鼠获得抗血清，western blotting及流式细胞仪器检测特异抗体的存在。结论：通过限制酶切分析及测序鉴定表明获得了人EGFR胞外段基因的pET原核表达载体，SDS－PAGE分析表明在IPTG诱导下可以表达90Kd目的蛋白其纯度大于95％，所产生抗体可以识别复性蛋白及表达于A549细胞上的EGFR。提示在大肠杆菌中表达的人EGFR胞外段重组蛋白具有免疫原性，可以进一步用于EGFR免疫研究。     

热休克蛋白90β(HSP90β)真核表达载体的构建及体外表达

目的克隆人热休克蛋白90β(HSP90β)基因,构建其真核表达载体pcDNA3.1( )/hHSP90β,并检测其在体外的表达情况,为下一步研究鼻咽癌中HSP90β功能奠定基础。方法提取鼻咽癌总RNA,并经RT-PCR获得hHSP90βcDNA。用纯化的hHSP90βcDNA与PGEM Easy T Vector连接,构建中间载体PGEM-hHSP90β。将PGEM-hHSP90β及pcDNA3.1( )质粒经AflII和Xbal双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,构建hHSP90β真核表达载体pcDNA3.1( )/hHSP90β。经酶切和测序后,用脂质体包裹转染COS细胞,采用RT-PCR和Western blot检测HSP90β的表达。结果酶切及测序鉴定表明,hHSP90β与pcDNA3.1( )体外重组成功,命名为pcDNA3.1( )/hHSP90β。该表达质粒在体外转染COS细胞后可表达HSP90β分子。结论采用体外重组技术,成功地将人HSP90β插到了真核表达载体pcDNA3.1( )中;pcDNA3.1( )/hHSP90β表达质粒能在体外表达HSP90β分子。     

小鼠骨髓间充质干细胞在体外对淋巴细胞增殖和凋亡的影响

骨髓间充质干细胞(MSC)是骨髓基质祖细胞,具有多向分化潜能,可应用于各种组织的修复和重建。MSC同时还具有调节免疫系统的作用。在体内及动物实验中,MSC可以减少移植物抗宿主病的发生率并减轻其严重程度。能够延长皮肤移植物的存活时间。国内也有资料显示MSC能够抑制脐血淋巴细胞的转化。但MSC对淋巴细胞的免疫抑制作用机制尚不清楚。我们对此进行了探索。     

希罗达一线治疗晚期或复发性结直肠癌

目的　评价希罗达 一线治疗中国人晚期或复发性结直肠癌的疗效及安全性。方法6 0例晚期或复发性结直肠癌患者均给予希罗达 口服 ,每日 2次 ,餐后服用 ,12 5 0mg·(m2 )·-1次 -1,连续服用 14d后停药 7d。治疗周期为 2 1d ,至少治疗 2个周期。结果　本组部分缓解 (PR) 14例 ,病情稳定 (SD) 2 4例 ,疾病进展 (PD) 15例 ,总有效率 2 3.3% ,中位生存期为 14 .7个月 ,1年生存率为 6 3.9% ,2年生存率为 33.4 %。Ⅲ、Ⅳ级不良反应主要为腹泻 4例 ,贫血 2例 ,手足综合征 1例。Ⅰ、Ⅱ级不良反应为皮肤色素沉着 2 0例 ,手足综合征 18例 ,腹泻 10例。结论　希罗达 治疗中国人晚期或复发性结直肠癌疗效肯定 ,患者耐受性良好。     

肌钙蛋白的克隆表达及对卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究肌钙蛋白（Troponin,TnI）对卵巢癌的治疗作用。方法:将TnI构建于原核表达载体PTrc99A并转化到大肠杆菌JM109中。细胞在LB培养基中培养到对数生长期后,加IPTG至终浓度为5mmol/L诱导。离心收集菌体,超声破菌。包涵体纯化并复性后在体内、体外抑制血管生成,并用于治疗荷有卵巢癌SKOV3的裸鼠,肿瘤体积每周测2次。结果:TnI能在体内和体外抑制血管生成。TnI治疗组肿瘤生长明显受到抑制,生存率升高。结论:TnI可抑制荷瘤小鼠的卵巢癌生长,延长其生存率。