第4批蛋白含量测定国家标准品的制备和标定

目的:建立蛋白含量测定用国家标准品。方法:按2005年版中国药典三部、WHO 和 ICH 标准品有关要求,对标准品进行制备、分装、冻干、质量检测并开展协作标定。结果:批号为2002/04的蛋白含量测定标准品经检测,外观、无菌实验合格。pH 为7.5,水分含量为0.7%。蛋白含量经过6家单位共计39次的凯氏定氮法协作标定后,确定其含量为21.24 mg·支~(-1),标准差为0.694 mg·支~(-1),总体 RSD 为1.06%。采用 Lowry 法对第3批蛋白含量测定国家标准品与该批蛋白标准品进行比较后,结果表明两者无显著差异。结论:该批蛋白含量测定标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准用于 Lowry 法蛋白含量测定,特定为第4批蛋白含量测定国家标准品。     

流体膜中重组人角质细胞生长因子-2含量测定

目的以甲壳素为主要基质制成以重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)为主要活性成分的新型制剂流体膜用于治疗烧烫伤促愈合,为该新制剂的质量标准制定可行的活性成分定量测定方法。方法利用rh-KGF-2的特异性抗体性质,采用酶联免疫法(间接ELISA法)测定其在该制剂中的含量,并进行了方法学验证。结果制剂中其它成分不干扰rhKGF-2的测定;线性范围为0~9μg.mL-1,回归系数为0.97,检测限度为0.56μg.mL-1;批内和批间精密度均较高,CV%分别为2.0%,1.01%;回收率为99.1%。测定了3批试制品,平均含量为1.62μg.mL-1。结论本方法简便,准确,可用于该制剂中rhKGF-2的含量测定。     

重组人白介素12质量标准与检测方法研究

目的：建立白介素12的质量标准与检测方法，用于该产品的质量控制。方法：采用诱导PBMC生成IFN-γ的方法测定生物学活性；用胰酶酶解分析肽图；用分子排阻HPLC、离子交换HPLC和SDS-PAGE法分析蛋白纯度；免疫印迹及N端氨基酸序列测定分析、鉴定产品特性。按照《中国药典》三部2005年版的有关规定进行了其他项目检查。结果：用建立的方法对重组人白介素12成品及原液进行检定，结果各项指标均符合《中国药典》的要求。结论：建立了重组人白介素12的质量标准，并可有效地控制制品的质量。     

酵母双杂交技术筛查与vasostatin相互作用的蛋白质

摘 要 目的: 通过酵母双杂交技术筛查与血管生长抑制因子vasostatin相互作用的蛋白质,为进一步阐明其抑制血管生成作用的分子机制奠定基础。方法: 应用第3代酵母双杂交系统，构建vasostatin诱饵质粒，经过表达和自激活验证后筛选预转化的人内皮细胞cDNA文库。将在四缺培养基中筛选得到的阳性克隆提取酵母质粒转化大肠杆菌，进行限制性酶切和测序，寻找可能与vastotatin具有相互作用的蛋白序列。结果： 经过酵母双杂交共获得21个克隆,经过验证,有3个阳性克隆;经过NCBI的BLAST进行同源性分析, 它们的核酸和蛋白序列与已知基因高度同源,它们分别为层黏连蛋白α5（7 547~8 112）和整合素αV（1 257~1 820、316~878）片段，均为重要的配体结合部位。Vasostatin蛋白通过与该区域结合，影响FAK、VEGF和bFGF等的信号通路，抑制血管生成。结论: 酵母双杂交筛选获得的层黏连蛋白和整合素蛋白的3个蛋白片段，它们与肿瘤内血管内皮细胞增殖和迁移等密切相关。     

重组腺病毒人白细胞介素2的质量分析

目的通过对重组腺病毒人白细胞介素2(Adv-IL2)的质量研究和实验方法参数的选择,建立Adv-IL2的质量控制标准。方法选用CPE法测定病毒滴度;将病毒转染Hela细胞,表达出IL-2,分别用MTT法和ELISA法测定IL-2的活性和表达量。建立了UV和IE-HPLC系统分析纯度;琼脂糖凝胶电泳检查基因组分子量和基因组酶切图谱;PCR法鉴定病毒特征基因E2B区、IL-2表达基因盒和外源因子(复制型病毒RCV,HIV,HBV和HCV);按照《中国生物制品规程》的有关规定进行了其他项目检查。结果测定的重组腺病毒人白细胞介素2原液滴度达3×10¹⁰ pfu·mL^-1。IL-2表达活性达700 U·mL^-1,表达量约25 ng·mL^-1。制品的A_{260 nm}/A_{280 nm}为1.23;IE-HPLC纯度检查大于98%。基因组分子量和基因组酶切图谱以及病毒特征基因E2B区和IL-2表达基因检查结果均在理论值范围;复制型病毒RCV,HIV,HBV和HCV检测均呈阴性;其他项目均符合规定。结论建立了重组腺病毒人白细胞介素2的质量标准,并可有效地控制制品的质量。     

应用shRNA技术研究NDRG2在人胃癌细胞SGC7901增殖中的作用

目的：构建针对人N-myc下游调节基因2（NDRG2）的短发夹RNA（shRNA）表达载体pSNAV-shRNA，观察其在SGC7901细胞中对NDRG2的抑制作用以及NDRG2被抑制后细胞增殖能力的变化。方法：PCR扩增针对NDRG2的shRNA表达框架，构建pSNAV-shRNA质粒，转染SGC7901细胞，通过RT—PCR，免疫印迹试验检测其对NDRG2表达的影响；通过细胞周期分析，软琼脂集落形成试验检测细胞增殖能力的变化。结果：将构建好的pSNAV—shRNA质粒转染SGC7901细胞后，NDRG2的表达受到明显的抑制，细胞周期G1期阻滞，集落形成能力降低。结论：构建的pSNAV—shRNA质粒能够有效抑制NDRG2在SGC7901细胞中的表达，降低SGC7901细胞的增殖能力。