乳牙期及替牙期反矫治器的几点体会

目的：纠正前牙反,去除不利于上颌骨发育的因素,刺激上颌骨生长,从而达到在上颌骨发育高峰期改变其抑制因素,解除前牙反,改善颜面部畸形外貌。方法：反患者50例,其中乳牙期21例、替牙期29例。其中使用口外颜兜装置8例、可摘式上颌垫活动矫治器14例、上颌扩弓矫治器7例、口外前方牵引装置（面具式）21例。结果：除外1例前牙反覆盖Ⅲ°变为Ⅰ°,其余病例前牙反解除,前牙反覆盖解除,上牙弓前后径、左右径均得到扩大,面形改善,全部恢复正常侧面容貌。结论：活动矫治器、功能矫治器的应用均可达到理想地解决乳牙期、替牙期反患者的目的。     

乳鼠心室肌细胞分离培养及鉴定方法的改良

目的探讨乳鼠心室肌细胞最佳培养及纯化的方法,为基础研究工作提供可靠的细胞模型。方法用0.25%胰蛋白酶分离乳鼠心室肌细胞,并用差速贴壁分离法和5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)纯化心肌细胞;通过光镜、透射电镜、免疫组化等观察和鉴定心肌细胞。结果光电显微镜下见细胞由圆形变为棱型或多角型,逐渐形成细胞簇或细胞单层,搏动频率50～160次/min;用抗肌动蛋白-actin的单克隆抗体鉴定心肌细胞呈阳性,见胞浆呈淡黄棕色;透射电镜可见肌小节、Z线、闰盘等。结论用胰蛋白酶培养的心肌细胞培养时间短、成功率高,是一种快速简便、值得进一步推广的方法     

兔在体心脏缺血再灌注模型的制作方法的改进

目的建立兔在体心脏缺血再灌注模型的新方法。方法40只新西兰大白兔随机分为缺血再灌注组(25只),假手术组(15只)。缺血再灌注组采用"二线二结"法结扎心脏左前降支30 min,然后恢复心肌灌注3h;假手术组仅将线从左前降支周围心肌中穿过,但并不结扎。实验中连续描记心电图。两组分别于结扎(穿线)前和再灌注(穿线)后1 h从股静脉取血1 mL测定血清肌钙蛋白。实验结束时取心肌行2,3,5-氯化三苯基四氮唑和苏木精-伊红染色。结果缺血再灌注组心电图存在ST-T的动态演变,再灌注1 h后血清肌钙蛋白浓度明显高于术前(0.47±0.35 vs.0.33±0.31,P=0.002)。两种染色方法均证明存在心肌坏死。结论"二线二结"法能够既方便又成功地建立兔在体心脏缺血再灌注模型。     

大鼠冠状动脉平滑肌细胞的分离及电压依赖性钾通道电流特性的初步研究

目的建立一种稳定、高效的大鼠冠状动脉平滑肌细胞(CASMCs)的急性酶分离方法,并对其电压依赖性钾离子通道(KV)进行研究。方法采用"三步"(依次用3种分离酶液)急性酶分离方法分离大鼠CASMCs,并进行细胞鉴定,采用膜片钳记录KV电流。结果①本分离方法可以获得数量较多,活性较好的平滑肌细胞;②测试电位为+60 mV时,KV电流密度达到最大值34.35±2.53 pA/pF,加入4-氨基吡啶后电流密度降至3.55±0.47pA/pF。两组之间电流密度的差异具有显著性(n=5,P<0.05)。KV稳态激活曲线的半数激活电压V1/2=23.66±1.03 mV,曲线斜率因子k=14.44±0.94 mV。结论 "三步"法为使用膜片钳记录CASMCs的离子通道电流提供了较好的研究方法。     

高血压大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的变化

目的研究在高血压背景下大电导钙激活钾(BK)通道的功能改变及其机制。方法用酶解消化方法分离12～16周龄自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠冠状动脉平滑肌细胞(CASMCS),采用膜片钳全细胞模式记录SHR和WKY大鼠CASMCSBK电流,SHR和WKY大鼠BKα亚基和β1亚基mRNA水平用实时定量取聚合酶链式反应和凝胶电泳测定,蛋白水平表达用免疫组化的方法测定。结果 SHR大鼠CASMCS(n=6)BK电流密度比WKY(n=7)高2.03±0.62(P0.01);在mRNA水平,BKβ1亚基表达SHR组明显高于WKY组5.534±1.03倍(n=4,P0.05),BKα亚基表达则无明显差异(1.266±0.12,n=4,P0.05);BKβ1亚基和α亚基的表达SHR大鼠高于WKY大鼠。结论 SHR大鼠CASMCSBK电流密度比WKY大鼠增大,在mRNA和蛋白水平上BKβ1亚基表达也比WKY大鼠增强,这种变化可能是机体在高血压时自我调节的结果 。     

辛伐他汀对慢性心力衰竭兔心肌细胞糖原合成激酶3β活性、蛋白表达及β-连环蛋白表达的影响

目的:观察辛伐他汀对慢性心力衰竭(心衰)兔心肌重构及心功能的影响,对心肌细胞中糖原合成激酶3β(GSK3β)活性、蛋白表达及β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响.方法:24只新西兰白兔分为4组,每组6只.假手术组:为健康对照.其余兔行主动脉瓣反流及腹主动脉缩窄术,建立慢性心衰模型后,分为心衰对照组:术后不给药;早干预组:术后第2天给予辛伐他汀5 mg/(d·kg),连续8周;晚干预组:术后第4周给予辛伐他汀5 mg/(d·kg),连续4周.术后8周观察结束时行左心导管检查,记录左心室舒张末压,处死后称体重、心脏重量、左心室重量,计算心脏质量指数(心脏重量/体重)、左心室质量指数(左心室重量/体重).West-ern-blotting分析心肌细胞浆GSK3β、细胞核β-catenin表达.免疫沉淀分析GSK3β活性.结果:术后8周时,心衰对照组左心室舒张末压、心脏重量、左心室重量、心脏质量指数及左心室质量指数均显著高于假手术组(P均<0.01);术后8周,早干预组心脏重量、左心室重量、心脏质量指数及左心室质量指数均显著低于心衰对照组(P<0.05-0.01);晚干预组心脏重量、左心室重量、心脏质量指数均显著低于心衰对照组(P<0.05-0.01).术后8周,早干预组及晚干预组左心室舒张末压均显著低于心衰对照组(P均<0.05).心衰对照组心肌胞浆中GSK3β活性较假手术组显著降低(P<0.01),而心肌细胞核B-catenin表达显著增加(P<0.01),差异均有统计学意义.早干预组及晚干预组GSK3β活性与心衰对照组比较均显著增加(P均<0.01),而心肌细胞核β-catenin表达均显著降低(P均<0.01).结论:辛伐他汀治疗有效抑制心力衰竭兔心肌重构、改善心功能;其作用与增加GSK3β活性、抑制心肌细胞核β-catenin表达有关.     

穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN4的构建及HCN4重组慢病毒的包装

目的将全长约3．6kb的HCN4目的基因片段从pCDNA3-HCN4质粒卸载下来,建立稳定的HCN4重组慢病毒。方法用EcoRI和XbaI从pCDNA3-HCN4质粒切下HCN4目的片段连接到Pucl9载体中,再用EcoRI和饿蒯Ⅲ从质粒Pucl9切下目的片段并连接到pcDNA3．1（A）载体中,再用XbaI单酶从质粒pcDNA3．1（A）双切到pCDHl-MCSl-EFl-copGFP中。用XbaI或者EcoRI鉴定,将阳性克隆质粒送上海生工测序,慢病毒的包装参照SBI的LentivectorExpressionSystem操作手册进行。将构建好的慢病毒包装质粒混合物混合后感染293T细胞及心肌样骨髓基质干细胞。结果（1）XbaI及EcoRI鉴定表明,PCR产物和克隆扩增产物的电泳结果显示该基因的大小约为3．6kb;阳性克隆质粒测序结果与GENEBANK目的基因HCN4序列完全相同;构建的目的基因质粒转染293细胞和原代猪骨髓间充质干细胞后,均发现有强烈的绿色荧光出现。（2）构建的慢病毒包装质粒混合物转染293细胞后,发现有强烈的绿色荧光出现,细胞感染率达90％以上。结论（1）成功将全长HCN4目的基因片段从pCDNA3-HCN4质粒卸载下来,成功构建穿梭质粒pCDHl-MCSl-EFl-copGFP。（2）成功建立稳定的HCN4重组慢病毒,该病毒载体有很高的转染效率。     

探讨血管紧张素Ⅱ对人脐静脉内皮细胞产生超氧阴离子和1型纤溶酶原激活物抑制剂的作用机制

目的:探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)产生超氧阴离子(O-2)和1型纤溶酶原激活物抑制剂( PAI-1)的作用机制及0-2与PAI-1产生之间的关系.方法:第一部分实验:观察血管紧张素Ⅱ不同浓度及不同作用时间对HUVEcs产生0-2和PAI-1的作用.分为对照组,AngⅡ10-8～10-5 moL/L不同浓度组,AngⅡ10-6mol/L作用不同时间(0、6、12、24和48h).第二部分实验:观察不同浓度的缬沙坦对AngⅡ诱导HUVECs产生O-2和PAI-1的作用.分为对照组,缬沙坦(10-6 mol/L)组,AngⅡ(10-6mo/L)组,AngⅡ(10-6mol/L)+不同浓度缬沙坦(10-8～ 10-5mol/L)组.第三部分实验:观察缬沙坦、二甲苯基碘、超氧化物歧化酶对AngⅡ使HUVECs产生O-2和PAI-1的作用.分为对照组,AngⅡ(10-6 mol/L)组,AngⅡ(10-6 mol/L)+缬沙坦(10-6mol/L)组,AngⅡ(10-6mol/L)+二甲苯基碘(10μmol/L)组,AngⅡ(10-6mol/L)+超氧化物歧化酶(2μl)组.用酶消化法收集并培养HUVECs,采用氯化硝基四氮唑蓝还原法测定上清液O-2浓度,用酶联免疫吸附法测定上清液PAI-1浓度.结果:①AngⅡ在10-8～10-5mol/L范围内呈浓度依赖性地使HUVECs产生O-2和PAI-1增加.②缬沙坦在10-8～10-5mol/L范围内呈浓度依赖性地降低AngⅡ促HUVECs产生O-2和P1AI-1的作用.③二甲苯基碘和超氧化物歧化酶可显著抑制AngⅡ刺激HUVECs产生0-2及PAI-1.结论:①AngⅡ通过作用于AngⅡ受体1(AT1)激活还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶途径呈浓度和时间依赖性地使HUVECs产生O-2和PAI-1增加.②AngⅡ通过增加O-2产生而致PAI-1产生增加,提示抗氧化治疗有助于预防血栓性疾病的发生.     

依那普利对自发性高血压大鼠心肌ACE和ACE2表达的影响

 目的 观察自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)心肌的血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)和ACE2的表达,以及依那普利干预的影响。方法 将15只SHR随机分为2组：SHR对照组(n=7)和依那普利组(n=8),分别给以安慰剂、依那普利15mg.kg-1.d-1灌胃干预4周。干预结束后处死大鼠,分离左心室,行RT-PCR、western blot蛋白质免疫印迹检测。同步取10只WKY大鼠作为正常血压对照组。结果SHR心肌的ACE的mRNA和蛋白质的表达都显著高于)WKY组(1.68±0.34 vs 0.33±0.12, P＜0.05;1.21±0.14 vs 0.71±0.11, P＜0.05),而ACE2 的mRNA和蛋白质表达皆明显低于WKY组(0.50±0.15 vs 1.16±0.24, P＜0.05; 0.71±0.24 vs 1.22±0.14, P＜0.05)。依那普利明显降低ACE的mRNA和蛋白质表达(0.44±0.19 vs 1.68±0.34, P＜0.01; 0.87±0.13 vs 1.21±0.14, P＜0.05),提升ACE2的mRNA表达(1.77±0.49 vs 0.50±0.15, P＜0.05),对ACE2的蛋白表达无明显影响(0.42±0.22 vs 0.71±0.24, P＞0.05)。结论 SHR心肌ACE明显升高,ACE2显著降低,有利于血压上调。依那普利能降低ACE,提升ACE2,可能是血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors, ACEI)的降压机制之一。