刺五加叶绿体的超微结构与刺五加苷B、E含量的关系

目的分析不同产地刺五加叶绿体超微结构特征及其与刺五加苷B、E含量的相关性。方法取野生刺五加叶片,利用超薄切片进行透射电镜观察叶绿体超微结构,测量叶绿体长、宽、周长和面积,HPLC法测定刺五加苷B、E含量。结果不同产地刺五加叶绿体超微结构间存在较大差异,叶绿体平均长、宽、周长分别为3.72μm、1.62μm、9.63μm,面积为5.17μm2,叶绿体宽与茎中刺五加苷E含量呈正相关关系,相关系数达0.819 38。结论叶绿体超微结构及其长、宽、周长、面积可以作为鉴定刺五加产地来源的指标,叶绿体宽度可作为茎中刺五加苷B含量的早期鉴定指标。     

根皮苷对食管癌细胞系表达谱的影响

目的 研究根皮苷对食管癌细胞系表达谱的影响,探索根皮苷作用于食管癌细胞系的信号通路及其潜在功能。方法 使用根皮苷处理人食管癌KYSE450细胞,提取总RNA并建立测序文库,进行转录组测序;使用DESeq2程序鉴定差异表达基因,对差异表达基因进行基因本体（gene ontology,GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析;使用MCODE进行差异基因核心模块筛选,使用GEPIA数据库分析核心模块中的基因对食管癌生存的影响;使用TIMER在线分析根皮苷对食管癌组织免疫细胞浸润的影响。结果 转录组测序结果显示,根皮苷处理后的食管癌细胞具有4602个差异表达基因,其中2407个为上调基因,2195个为下调基因。通路富集分析显示,根皮苷对蛋白质加工、胰岛素抵抗、基因复制和细胞周期等信号通路产生影响。在差异表达基因核心模块中,E3泛素蛋白连接酶2（E3 ubiquitin ligase mind bomb 2,MIB2）高表达可降低食管癌患者的总体生存率;环指蛋白19B（ring finger protein 19B,RNF19B）、三重基序蛋白69（tripartite motif-containing protein 69,TRIM69）、泛素连接酶（ubiquitin conjugating enzyme,UBC）和克隆E3泛素连接酶（homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 2,HECTD2）的表达水平可影响食管癌癌组织的纯度以及免疫细胞浸润的类型。结论 根皮苷可影响食管癌细胞的转录谱,其差异表达基因主要集中在细胞生长相关的信号通路。     

刺五加钙调蛋白基因的克隆及内生真菌对其表达的影响

目的:克隆刺五加的钙调蛋白(calmodulin,CaM)基因,并分析内生真菌对其表达的影响。方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加CaM基因的全长cDNA序列。通过RT-PCR法检测可显著提高刺五加皂苷含量的内生真菌菌株P116-1a,P116-1b,P109-4,P312-1对CaM表达的影响。结果:刺五加CaM基因的cDNA全长为856 bp,开放阅读框长450 bp,编码149个氨基酸的蛋白,与人参Panax ginseng和胡萝卜Daucus carota等物种的CaM同源性均高达100%。RT-PCR的结果显示,内生真菌可显著提高刺五加CaM基因的表达量(P<0.05),最大表达量出现在菌株P109-4回接90 d时,达对照的2.96倍。结论:首次克隆并报道了刺五加CaM的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加CaM基因的表达量,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷含量的机制奠定了基础。     

多穗柯无色花青素还原酶基因的克隆及其表达与根皮苷含量的相关性分析

目的克隆多穗柯Lithocarpus polystachyus的无色花青素还原酶(leucoanthocyanidin reductase,LAR)基因,并对其表达量与根皮苷含量的关系进行分析。方法根据多穗柯转录组测序的结果(Unigene号:DN30711_c0_g1_i1),利用PCR法扩增获得多穗柯LAR基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测LAR基因的表达量,使用UPLC法测定根皮苷的含量,应用SPSS18.0软件分析LAR基因表达量与根皮苷含量间的相关关系。结果多穗柯LAR基因的cDNA全长1 053 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码350个氨基酸。该蛋白不存在跨膜区域,定位于细胞质中。多穗柯LAR蛋白属于PCBER_SDR_a家族,与栓皮栎LAR蛋白具有较高的相似性(95%),且亲缘关系最近。多穗柯的根皮苷含量与LAR基因的表达量呈正相关(P0.05)关系。结论首次克隆得到多穗柯LAR基因,并证实多穗柯根皮苷含量与LAR基因的表达量呈正相关,为揭示多穗柯中根皮苷的生物合成机制奠定理论和技术基础。     

刺五加内生镰刀霉菌培养基的优化

①目的 筛选出一种适合提高刺五加苷含量的内生镰刀霉菌P109-4生长的培养基.②方法 将P109-4接种于6种基础培养基中,30℃下培养,对其生长状况进行观察,并在12、24、36、48、60、72h时段测量菌落大小.筛选出一种长速率最快的的培养基.再对其进行改良找到能使P109-4生长最快的培养基.③结果 P109-4在6种基本培养中生长状况明显不同,30℃培养72h后内生菌在牛肉膏蛋白胨、高氏一号、查氏培养基、PDA培养基、乳糖牛肉膏蛋白胨培养基、LC培养基的生长直径分别为4.00、3.70、3.75、3.90、3.20、3.20、3.63cm.在改良牛肉膏蛋白胨培养基试验中,培养72h后牛肉膏蛋白胨培养基、改良牛肉膏蛋白胨培养基1号、改良牛肉膏蛋白胨培养基2号生长直径分别为3.30、3.45、3.20cm.④结论 经过72h菌落直径的比较,刺五加内生镰刀霉菌在改良牛肉膏蛋白胨培养基1号,生长速率更快.     

刺五加环阿屯醇合酶基因的克隆及其表达分析

目的 克隆刺五加的环阿屯醇合酶（cycloartenol synthase,CAS）基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术克隆刺五加CAS基因的全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过RT-PCR法检测CAS在不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果 刺五加CAS基因的cDNA全长为2 758 bp,开放阅读框长2 277 bp,编码758个氨基酸的蛋白,包含三萜合成酶的标志性序列。CAS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中。RT-PCR的结果显示,刺五加CAS基因在各时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异（P＜0.05）。其中果实基本成熟期的表达量最高,是最低量萌芽期的1.56倍,各器官中,叶片的表达量最高,是最低量叶柄的1.37倍。结论 首次分离并报道了刺五加的CAS cDNA克隆,并证实其在不同生长发育时期和不同器官中的表达量不同,为进一步研究CAS对刺五加皂苷量的影响和表达调控奠定基础。     

刺五加法尼基焦磷酸合酶、鲨烯合酶、鲨烯环氧酶基因启动子CpG岛的预测与功能验证

目的获得刺五加法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SS)、鲨烯环氧酶(SE)基因启动子的CpG岛分布情况和功能活性。方法针对已克隆的FPS、SS、SE基因启动子序列,使用EMBOSS和Li Lab进行CpG岛预测,同时利用GUS基因作为报告基因,p CAMBIA1301质粒作为表达载体,利用根癌农杆菌转化拟南芥进行功能验证。结果发现刺五加FPS、SS启动子含有2个CpG岛,长度分别是520、218 bp和108、103 bp,SE启动子含有3个CpG岛,长度为290、119、149 bp。FPS、SS、SE基因启动子均具有启动活性,但强度不一,SS启动子活性最强。结论研究首次获得刺五加FPS、SS、SE基因启动子区域的CpG岛分布情况,以及其功能活性,为后续进一步FPS、SS、SE甲基化分析及其在刺五加中的表达调控研究奠定了基础。     

刺五加鲨烯合酶和鲨烯环氧酶基因单核苷酸多态性及其与总皂苷量的相关性研究

目的 筛选刺五加鲨烯合酶（SS）和鲨烯环氧酶（SE）基因存在的单核苷酸多态性（SNP）位点,分析各SNP位点与刺五加总皂苷量的相关性。方法 采用分光光度法测定刺五加总皂苷的量,并划分为具有显著差异（P＜0.01）的高、低量组;RT-PCR法扩增刺五加SS、SE基因,根据测序结果筛选SNP位点,利用R×C表的χ²检验分析相关关系。结果 刺五加SS基因存在6处SNP,其中704 bp位点为错义突变,其他位点为同义突变,各位点均不与刺五加总皂苷量显著相关。SE基因存在9处SNP,其中导致错义突变的164、199、227、232 bp位点及同义突变的279、285 bp位点与刺五加总皂苷量显著相关（P＜0.05）,其他位点为同义突变,与刺五加总皂苷量间无显著相关性。结论 刺五加SS和SE基因存在SNP,SE基因164～285 bp位点的AGAACG与刺五加总皂苷高量组显著相关,TAGTTC与低量组显著相关。     

刺五加环阿屯醇合酶基因的克隆及其表达分析

目的克隆刺五加的环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNAends,RACE)技术克隆刺五加CAS基因的全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过RT-PCR法检测CAS在不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果刺五加CAS基因的cDNA全长为2 758 bp,开放阅读框长2 277 bp,编码758个氨基酸的蛋白,包含三萜合成酶的标志性序列。CAS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中。RT-PCR的结果显示,刺五加CAS基因在各时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。其中果实基本成熟期的表达量最高,是最低量萌芽期的1.56倍,各器官中,叶片的表达量最高,是最低量叶柄的1.37倍。结论首次分离并报道了刺五加的CAS cDNA克隆,并证实其在不同生长发育时期和不同器官中的表达量不同,为进一步研究CAS对刺五加皂苷量的影响和表达调控奠定基础。     

DNA甲基化及重亚硫酸盐测序法在药用植物中的应用策略

DNA甲基化是目前研究最为广泛的一种表观遗传学现象,甲基化后的DNA可在不改变碱基序列的情况下对植物的表型进行调控。在高等植物中有CG、CHG和CHH(H代表A、C或T)3种甲基化位点,多发生于对称序列CG和重复序列中,且不同物种中的甲基化程度和模式不同。药用植物功能基因启动子区域的DNA发生甲基化后,可抑制基因的表达,进而影响其次生代谢产物的积累,导致品质差异的形成。在众多的DNA甲基化检测方法中,重亚硫酸盐测序法可在单核苷酸水平上鉴别DNA甲基化的位点和程度,是DNA甲基化分析的金标准。对其进行引物优化、技术改良后,可有效地揭示药用植物的DNA甲基化情况,这为阐明经典遗传学不能完全解释的药用植物品质差异等问题提供了技术支持,并开辟了新的研究方向。