刺五加Actin 基因cDNA 全长序列的克隆与生物信息学分析

目的：克隆刺五加Actin 基因的全长cDNA 序列,并对其进行生物信息学分析。方法：以刺五加的叶片为材料,提取总RNA,逆转录为cDNA,根据初步克隆到的刺五加Actin 基因保守序列设计引物,利用套式PCR 进行3' 和5'RACE 扩增,得到Actin 基因的3' 和5' 端cDNA 序列片段,拼接获得cDNA 全长。将该序列进行BLAST 比对、相似度分析,并对刺五加Actin1 蛋白的二级结构和三级结构进行预测。结果：刺五加的Actin 基因全长1 507 bp,命名为ESActin1,注册号KC469585 。该基因开放阅读框（ORF）长1 134 bp,编码377 个氨基酸,5' 端非编码区长140 bp,3' 端非编码区长233 bp。ESActin1 与GenBank 中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在75%以上,蛋白质序列的相似性在94%以上。结论：首次报道了刺五加Actin 基因的全长cDNA 序列,为刺五加的分子生物学研究奠定基础。     

应用SEFA-PCR扩增刺五加内生青霉鲨烯合酶基因的旁邻序列

①目的 克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的旁邻序列.②方法 根据已经获得的P.minioluteum P116-1a SS DNA序列设计特异性性引物,采用SEFA-PCR(self-formed adaptor PCR)扩增其3'和5'末端未知序列.③结果 3'末端扩增获得长约5 000 bp的片段,5'末端扩增获得长约3 000bp的片段.④结论 首次应用SEFA-PCR技术扩增获得P.minioluteum P116-1a SS基因的末端序列,为进一步研究该基因对刺五加皂苷含量的作用机制奠定了基础.     

刺五加β-香树酯醇合成酶基因的克隆及其表达与皂苷量的相关性

目的克隆刺五加的β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)基因,并分析其表达对皂苷量的影响。方法利用同源克隆法克隆刺五加的bAS基因。利用Real time PCR技术,分析刺五加bAS基因的表达规律,分光光度法测定总皂苷量。结果克隆到cDNA长度分别为1223、1226 bp的刺五加bAS1、bAS2基因。bAS1和bAS2基因在各时期和器官中均有表达,但表达量差异显著(P0.05)。bAS1基因在萌芽期的表达量最高,之后迅速降低,并基本维持恒定。在整个生长期中bAS2表现出低→高→低的表达特点。bAS1基因在各器官中的表达量基本恒定,bAS2基因在叶片中的表达量最高。茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,bAS1基因的表达未发生显著变化,bAS2的表达量显著上升。刺五加的皂苷量与bAS2呈极显著的正相关关系(P0.01),bAS1基因未达显著水平。结论 bAS2可能是催化刺五加三萜皂苷生物合成的关键酶。     

刺五加的体细胞胚胎发生研究

目的用不同质量浓度2,4-D和外植体类型对刺五加体细胞胚胎诱导进行研究,为刺五加的资源保护和遗传工程提供理论依据。方法以刺五加的萌发3周幼苗和层积处理种子合子胚的胚根、下胚轴和子叶为外植体,考察不同激素对刺五加体细胞胚胎发生的影响。结果来自层积处理种子合子胚的外植体接种于附加0.5 mg/L2,4-D的MS或1/2MS培养基中体细胞胚胎诱导率(57.1%)和数量(3.3)最高。体胚在原培养基中即可发育成熟,转入降低2,4-D质量浓度的培养基后更有利于新体胚的产生和原有体胚的成熟。刺五加体胚的发育历程与合子胚相似。结论刺五加可以通过来自合子胚的外植体实现体细胞胚胎发生,体胚诱导率取决于2,4-D质量浓度和外植体的发育程度。     

多穗柯查耳酮异构酶基因的克隆与序列分析

目的克隆多穗柯的查耳酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)基因,并了解其表达情况。方法根据转录组测序结果,利用PCR扩增技术获取多穗柯CHI基因的c DNA全长,并对其进行生物信息学分析,采用qRT-PCR法检测CHI基因在多穗柯不同器官的表达量。结果多穗柯CHI基因的c DNA全长为772 bp,开放阅读框长为696 bp,编码231个氨基酸的蛋白。该蛋白不存在跨膜区域,定位于细胞质中。多穗柯CHI基因在不同部位均有表达,叶片的表达量最高,是根部最低量的9.75倍。结论首次克隆获得多穗柯的CHI基因,明确该基因属于CHI II型。且多穗柯CHI基因在各器官中的表达量具有显著差异。     

五加科植物叶绿体基因组结构与进化分析

目的获取五加科叶绿体基因组的结构特征以及进化关系。方法以已测序完成的10个属的20种五加科植物叶绿体基因组为研究对象,系统比较基因组间的差异,分析4个IR边界扩张与收缩情况,并以近缘物种当归为外类群,使用MEGA 4.0构建系统进化树,分析物种间的亲缘关系。结果 20种五加科植物的叶绿体基因组大小差异较小,最大差仅1 909bp。各物种均出现基因替换现象,由cem A基因替换ycf10基因,且数量存在一定差异,主要由t RNA引起。通过比较发现,五加科物种的4个IR边界比较保守,仅野三七、三七和穗序鹅掌柴的边界基因进入IR区的长度与其他物种的差异较大。以当归为外类构建的系统进化树,各节点的支持率较高,清晰地反映了各物种间的亲缘关系。结论叶绿体基因组涵盖的信息量大,可以用于分析关系较近与进化较快物种的系统发生问题。     

糖尿病视网膜病与血管紧张素Ⅰ转换酶基因多态性关联研究

糖尿病晚期并发症主要分为小血管病(如肾病、视网膜病)和大血管病(如心血管障碍),是糖尿病患者高度致残和致死的主要原因。研究表明,这些并发症的发生与遗传因素有关。而编码肾素-血管紧张素系统蛋白产物的基因,是与糖尿病血管病并发症有关的候选基因。血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)是肾素-血管紧张素系统的重要成分,可将血管紧张素Ⅰ转换成具有血管收缩、促进血管和心肌平滑肌细胞增殖,并经肾上腺皮质醛固酮加强肾钠重吸收作用的血管紧张素Ⅱ。ACE基因位于17q23,其中第16内含子存在一个插入/缺失(ID)型多态性,插入大小为287bp,并由Alu重复序列构成。本文探讨糖尿病视网膜病患者ACE基因多态性,并与无并发症的糖尿病患者组比较,旨在确定其基因与糖尿病视网膜病是否存在关联。     

刺五加内生镰刀霉菌培养基的优化

①目的 筛选出一种适合提高刺五加苷含量的内生镰刀霉菌P109-4生长的培养基.②方法 将P109-4接种于6种基础培养基中,30℃下培养,对其生长状况进行观察,并在12、24、36、48、60、72h时段测量菌落大小.筛选出一种长速率最快的的培养基.再对其进行改良找到能使P109-4生长最快的培养基.③结果 P109-4在6种基本培养中生长状况明显不同,30℃培养72h后内生菌在牛肉膏蛋白胨、高氏一号、查氏培养基、PDA培养基、乳糖牛肉膏蛋白胨培养基、LC培养基的生长直径分别为4.00、3.70、3.75、3.90、3.20、3.20、3.63cm.在改良牛肉膏蛋白胨培养基试验中,培养72h后牛肉膏蛋白胨培养基、改良牛肉膏蛋白胨培养基1号、改良牛肉膏蛋白胨培养基2号生长直径分别为3.30、3.45、3.20cm.④结论 经过72h菌落直径的比较,刺五加内生镰刀霉菌在改良牛肉膏蛋白胨培养基1号,生长速率更快.     

刺五加环阿屯醇合酶基因的克隆及其表达分析

目的 克隆刺五加的环阿屯醇合酶（cycloartenol synthase,CAS）基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术克隆刺五加CAS基因的全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过RT-PCR法检测CAS在不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果 刺五加CAS基因的cDNA全长为2 758 bp,开放阅读框长2 277 bp,编码758个氨基酸的蛋白,包含三萜合成酶的标志性序列。CAS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中。RT-PCR的结果显示,刺五加CAS基因在各时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异（P＜0.05）。其中果实基本成熟期的表达量最高,是最低量萌芽期的1.56倍,各器官中,叶片的表达量最高,是最低量叶柄的1.37倍。结论 首次分离并报道了刺五加的CAS cDNA克隆,并证实其在不同生长发育时期和不同器官中的表达量不同,为进一步研究CAS对刺五加皂苷量的影响和表达调控奠定基础。     

根皮苷对食管癌细胞系表达谱的影响

目的 研究根皮苷对食管癌细胞系表达谱的影响,探索根皮苷作用于食管癌细胞系的信号通路及其潜在功能。方法 使用根皮苷处理人食管癌KYSE450细胞,提取总RNA并建立测序文库,进行转录组测序;使用DESeq2程序鉴定差异表达基因,对差异表达基因进行基因本体（gene ontology,GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析;使用MCODE进行差异基因核心模块筛选,使用GEPIA数据库分析核心模块中的基因对食管癌生存的影响;使用TIMER在线分析根皮苷对食管癌组织免疫细胞浸润的影响。结果 转录组测序结果显示,根皮苷处理后的食管癌细胞具有4602个差异表达基因,其中2407个为上调基因,2195个为下调基因。通路富集分析显示,根皮苷对蛋白质加工、胰岛素抵抗、基因复制和细胞周期等信号通路产生影响。在差异表达基因核心模块中,E3泛素蛋白连接酶2（E3 ubiquitin ligase mind bomb 2,MIB2）高表达可降低食管癌患者的总体生存率;环指蛋白19B（ring finger protein 19B,RNF19B）、三重基序蛋白69（tripartite motif-containing protein 69,TRIM69）、泛素连接酶（ubiquitin conjugating enzyme,UBC）和克隆E3泛素连接酶（homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 2,HECTD2）的表达水平可影响食管癌癌组织的纯度以及免疫细胞浸润的类型。结论 根皮苷可影响食管癌细胞的转录谱,其差异表达基因主要集中在细胞生长相关的信号通路。