体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞的研究

目的 基于肝脏发育生物学进展，建立有效诱导胚胎干细胞（ESC）向肝细胞分化的体外培养体系。方法 小鼠ESC细胞系E14，在内含1000U／ml的rmLIF的无饲养层高糖DMEM培养基中培养，去除rmLIF后用悬滴培养法制备成拟胚体。依次加入10^-7M的Dexamethasone、10μg／L的FGF-4、25μg／L的HGF等诱导因子，继续培养1～2周。然后取分化细胞，行细胞形态学观察、免疫细胞化学染色检测白蛋白和CK8／18的表达、RT-PCR检测白蛋白和转甲状腺蛋白等肝细胞特征性蛋白的mRNA转录水平。糖原染色、尿素合成功能检测则对其功能进行检验。结果 ESC体外培养生长旺盛，呈”巢状”克隆性增殖。去除rmLIF后悬浮培养，一般2～3d可制备成拟胚体。序贯加入Dex、FGF-4和HGF等诱导因子进行分化培养后，约于ED12可见分散、克隆样增殖的小上皮样细胞集落，ED19左右有较多细胞分化为多角形的肝细胞样细胞。免疫组化染色，见胞浆内出现棕黄色颗粒，表达肝细胞特有的白蛋白以及CK8／18等蛋白。RT-PCR显示有白蛋白、转甲状腺蛋白等的mRNA转录。糖原染色见胞浆内存在红色颗粒，呈阳性反应；尿素合成功能检测显示，培养液内可见尿素氮的逐日升高，说明细胞具有肝细胞特有的糖原合成、尿素合成和分泌功能。结论 加入FGF-4、HGF和Dex等肝脏胚胎发育时期的关键性调控因子的体外培养体系可以诱导胚胎干细胞分化为肝细胞样细胞。     

沙培林和平阳霉素注射治疗婴儿血管瘤临床对比研究

目的探讨平阳霉素、沙培林用于血管瘤注射治疗的疗效。方法将1月到1岁的120个小儿增生期血管瘤随机分为瘤体内注射平阳霉素组和注射沙培林组各60例，观察治疗效果和并发症。结果平阳霉素组的有效和显效率明显优于沙培林组（P〈0．05），两组的并发症除发热（P〈0．005）外，其余并发症均无统计学意义（P〉0．05）。结论瘤体内注射沙培林和平阳霉素治疗血管瘤均是有效，但以平阳霉素的疗效较佳。     

小儿腹股沟斜疝诊治分析

小儿腹股沟斜疝是小儿常见疾病之一,治疗不当或不及时,会导致复发,有些患儿将来不育;而且小儿腹股沟斜疝嵌顿进而绞窄的机会较成人大,后果严重。我院近2年共收治86例该病患者,其中有26例为双侧性腹股沟斜疝,现报告如下。 临床资料 一、一般资料:86例患者中,男78例,女8例。年龄9个月～13岁,平均4岁6个月。病史最长8年,最短6个小时。单侧患者60例,右侧53例,左     

应用淤胆血清"病理微环境"从ESC中筛选肝干细胞的研究

目的:探讨淤胆血清"病理微环境" 培养体系诱导胚胎干细胞(ESC)向肝细胞分化的效果及对肝干细胞的筛选作用.方法:将小鼠ESC细胞系E14在无白血病抑制因子培养基中培养,使其自发分化为拟胚体,加入FGF-4和HGF初步诱导,然后置于5%淤胆鼠血清"病理微环境"筛选培养液中继续培养2周,然后进行细胞形态学观察,ALB和CK8/18免疫荧光染色,电镜检查和吲哚氰绿(ICG)摄取试验.结果:经初步诱导分化的ESC置于5%淤胆血清"病理微环境"筛选培养液中培养,初期细胞生长受抑制,部分细胞坏死、凋亡并脱落.1周左右可见上皮样细胞集落呈优势生长.2周左右可见较多肝细胞样集落形成单位(H-CFU),大部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞,呈现较好的均质性,从中央到周边呈逐渐分化成熟的趋势;免疫荧光染色显示ALB和CK8/18表达;电镜检查可见与肝细胞相似的超微结构;吲哚氰绿(ICG)摄取试验可见大量ICG阳性细胞,提示这些细胞具备部分肝细胞特性,且筛选诱导组ICG阳性率显著高于对照组(P ＜ 0.05).结论:采用含淤胆血清的"病理微环境"培养体系从经FGF-4和HGF初步诱导的胚胎干细胞中有效筛选出了具有功能的肝细胞样细胞.     

糖尿病对大肠癌术后并发症的影响

目的 探讨大肠癌围手术期糖尿病的影响及处理。方法 对６３例大肠癌并存糖尿病患者围手术期诊断与治疗进行回顾性分析。结果 ６３例病人均行择期手术,糖尿病以２型多见,术后并发症发生率;切口感染１３例,吻合口瘘３例,骶前积脓２例,肺部感染２例,腹腔脓肿１例,泌尿系感染３例,高渗性非酮症昏迷２例并随后死亡,酮症酸中毒１例,术后平均住院２３ｄ。     

胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植对宿主肝功能的影响及安全性评估

背景：体外诱导胚胎干细胞分化为肝细胞已有不少成功的报道，但其体内移植后能否有效整合入宿主肝板、在肝内能否进一步生长分化并表达肝细胞功能以及成瘤的风险等情况目前还不清楚。 目的：应用治疗性肝再生模型进行胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植．观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性情况。 设计：随机对照动物实验。 单位：中山大学附属第二医院小儿外科。 材料：选用BALB／c小鼠24只为受体，鼠龄6～8周，体质量20～352，雌雄不拘购自广州市实验动物中心。实验所用胚胎干细胞源性肝干细胞由作者所在课题组诱导胚胎干细胞分化而成。小鼠胚胎干细胞株E14由本院干细胞中心提供。 方法：实验于2006-07／2007-06在中山大学附属第二医院干细胞研究中心完成。将24只小鼠随机分为2组：肝再生模型＋干细胞移植组和肝切除＋干细胞移植组，每组12只。前组分两次按50mg／kg剂量腹腔内注射倒千里光碱（retrorsine），间隔2周，第2次注射4周后行70％肝部分切除制造肝损伤；然后经门静脉分别移植1×10^5羟基荧光素乙酰乙酸（CFDA-SE）荧光标记的细胞入小鼠肝内进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。后组在行70％肝部分切除制造肝损伤模型后进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。 主要观察指标：荧光显微镜下观察移植细胞组受体鼠肝脏内分布、整合与体内生长分化情况。2周后行白蛋白荧光免疫组化（双荧光染色）、血清白蛋白水平检测其功能状况。将胚胎干细胞源性肝干细胞注入治疗性肝再生小鼠肝内，将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下作为对照，观察胚胎干细胞源性肝干细胞体内成瘤情况。 结果：①肝干细胞在受体鼠肝内生长情况：CFDASE标记的胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植1周，受体小鼠肝实质内可见散     

人肝脏特异性miR-122重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建microRNA-122(miR-122)的重组过表达慢病毒,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究miR-122的功能和作用机制奠定基础。方法利用PCR法扩增人类基因组DNA中miR-122发夹前体结构RNA,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经酶切及基因测序鉴定,将阳性重组PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro表达载体、p CMV-VSV-G和p CMVdR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收获上清液,将所得病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白进行病毒滴度测定。将重组慢病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞,并利用实时定量PCR检测miR-122的表达。结果重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为3×108TU/m L的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维细胞后miR-122表达明显增强。结论通过优化miRNA载体构建方法成功构建人miR-122的重组慢病毒载体并可在人类成纤维细胞内显著过表达miR-122,为miR-122的研究提供更高效稳定的基因载体。     

脾内肝细胞移植(综述)

脾内移植的肝细胞不仅能在脾内长期存活和增殖,同时也具有一定的功能.借自体或同种异体肝细胞移植以形成肝化脾有可能成为终末期肝病、难治性肝病的一种可供选择的治疗方法.本文就脾内肝细胞移植的研究进展及临床应用做一简要综述.     

人肝细胞核因子4α重组慢病毒载体的构建与鉴定

【摘要】〓目的〓构建肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha, HNF4A)的过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究HNF4A的功能和作用机制奠定基础。方法〓利用PCR法扩增人类基因组DNA中HNF4A的cDNA序列,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro表达载体、pCMV-VSV-G 和pCMV-dR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收集上清,将获得的病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白检测病毒滴度。将重组慢病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞HFFs,并利用荧光定量PCR检测HNF-4A的表达。结果〓重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维细胞后HNF4A表达显著增强。结论〓通过优化载体构建方法成功构建人HNF4A的重组慢病毒载体并可在HFFs内显著过表达HNF4A,为HNF4A的研究提供更高效稳定的基因载体。     

热诱导调控序列的合成及其热诱导特性的研究

目的 探讨合成热诱导性的HSP70启动子调控序列,并鉴定加热条件下诱导其下游报告基因表达的特性。方法 利用PCR方法,以肝癌细胞株HepG2基因组为模板,体外合成热休克蛋白70（HSP70）启动子序列。利用双酶切法构建HSP70启动子调控的含EGFP报告基因的真核表达载体pcDNA-HSP70-EGFP。以脂质体为载体,体外转染肝癌细胞株HepG2,在不同的温度下（37℃、39℃、41℃、43℃、45℃）加热不同时间（0、15、30、45、60min）后,利用流式细胞术检测报告基因EGFP表达强度,从而判定温度及时间对HSP70启动子热诱导活性的影响。结果 合成的HSP70启动子序列测序结果与GeneBank 中AL671762所提供序列完全一致。低温加热后EGFP在HepG2细胞中的表达强度不同程度增强,在43℃/30 min 时最为明显,为未加热组的3.3倍。结论 成功合成可热诱导的HSP70启动子序列;HSP70启动子在低温加热下能明显增强其下游外源基因的表达,为进一步研究肿瘤热疗-基因治疗提供了实验基础。